劉承毅,吳雪輝

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣州 510642；2.廣東省油茶工程技術(shù)研究中心，廣州 510642)

原花青素(proanthocyanidins)，是一類植物中廣泛存在的黃烷醇單體及其聚合體的多酚類化合物[1]。其單體主要包括兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素等[2]，單體通過聚合形成二聚體至多聚體，其中以C6-C4或C8-C4連接形成的多聚體為B型原花青素，以C2-O-C5或C2-O-C7等方式連接形成的多聚體為A型原花青素[3]。原花青素是一種天然的強(qiáng)抗氧化劑，常常作為添加劑應(yīng)用于飲料、酒等中[4]。此外，有研究表明原花青素還具有降血糖、預(yù)防心血管疾病等作用[5-6]。

通過抑制口腔及腸道中α-淀粉酶的活性，可以減少對(duì)淀粉類食物的分解，降低人體對(duì)糖類的吸收，來達(dá)到降低血糖及防治糖尿病的目的[7]。原花青素具有較好的抑制α-淀粉酶活性的效果，Ann Barrett等[8]研究了可可、石榴、蔓越莓、葡萄中原花青素對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用，結(jié)果顯示：4種原花青素對(duì)α-淀粉酶活性均有一定的抑制作用；劉睿等[9]也發(fā)現(xiàn)高粱原花青素能夠有效抑制α-淀粉酶活性。

油茶果殼(Camelliaoleiferashell)是油茶籽果實(shí)的外種皮，占鮮果重量的50%～60%，因?qū)ζ淅梅绞接邢?，果殼常常被作為廢棄物丟掉，造成了資源的浪費(fèi)[10]。油茶果殼中含有豐富的原花青素[11]，目前，從果殼中提取原花青素及對(duì)α-淀粉酶活性抑制方面的研究較少，因此本文以油茶果殼為原料，采用溶劑提取法，利用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化原花青素的提取工藝，并探究對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用，以期為油茶果殼的高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油茶果：采自東莞市樟木頭林場(chǎng)。

無水乙醇(分析純)：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；濃硫酸、香草醛、酒石酸鉀鈉、亞硫酸鈉(分析純)：廣州化學(xué)試劑廠；可溶性淀粉：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；3，5-二硝基水楊酸(純度≥98%)：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；原花青素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥95%)：上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；豬胰α-淀粉酶(10 U/mg)：美國Sigma-Aldrich公司；阿卡波糖：上海伊卡生物技術(shù)有限公司。

UV-5200型紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；BJ-150型多功能粉碎機(jī) 德清拜杰電器有限公司；JJ1000型電子天平 常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；HWS24型電熱恒溫水浴鍋 廣州航信科學(xué)儀器有限公司；101-2A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

將油茶果殼洗凈后切塊，于45 ℃的烘箱中烘干至恒重，粉碎過40目篩，密封、避光儲(chǔ)存于干燥箱中備用。

1.2.2 原花青素含量的測(cè)定

原花青素含量的測(cè)定參考孫蕓等[12]的方法并略做修改。

1.2.2.1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別加入0.50 mL濃度為0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mg/mL的原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，依次加入2.50 mL 1%香草醛-甲醇溶液、2.50 mL 30%濃硫酸-甲醇溶液，在30 ℃溫度下避光水浴30 min。反應(yīng)結(jié)束后，搖勻，用紫外分光光度計(jì)測(cè)500 nm 處的吸光值。以原花青素濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 樣品中原花青素含量的測(cè)定

取0.50 mL甲醇稀釋后的原花青素樣液按照1.2.2.1的方法進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用紫外分光光度計(jì)測(cè)500 nm處的吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中原花青素濃度，并利用下式計(jì)算原花青素得率：

(1)

式中：C為測(cè)得的原花青素濃度，mg/mL；V為樣液體積，mL；n為樣品稀釋倍數(shù)；m為油茶果殼粗粉質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

1.2.3.1 油茶果殼中原花青素的提取

稱取5組，每組2.00 g的果殼粗粉，加入體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇溶液，控制料液比為1∶20 (g/mL)；置于恒溫水浴鍋中，在50 ℃溫度下提取1 h，抽濾得濾液，提取1次，按照1.2.2.2的方法測(cè)定并計(jì)算原花青素的得率。

1.2.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)1.2.3.1中原花青素的提取方法，在控制其他條件相同的情況下，僅改變其中一個(gè)條件，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(0%、20%、40%、60%、80%)、提取溫度(30，40，50，60，70，80，90 ℃)、提取時(shí)間(2，4，8，12，20，30，60 min)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g/mL)和提取次數(shù)(1，2，3，4，5次)對(duì)原花青素得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

綜合單因素試驗(yàn)，選取對(duì)原花青素得率影響較大的3個(gè)因素，即：乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取時(shí)間，分別以A，B，C表示。以A，B，C為自變量，以原花青素得率為響應(yīng)值(Y)進(jìn)行試驗(yàn)。采用Design-Expert 10對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。每一自變量的低、中、高試驗(yàn)水平分別以-1，0，1進(jìn)行編碼。

1.2.5 α-淀粉酶活性抑制作用測(cè)定

參考丁華杰等[13]的方法并略做修改，向25.00 mL具塞刻度試管中依次加入0.50 mL 2.00 mg/mL α-淀粉酶溶液、0.50 mL 0.20 mol/L磷酸緩沖液、0.50 mL不同濃度的原花青素溶液，于37 ℃水浴鍋中反應(yīng)10 min，然后加入0.50 mL在37 ℃預(yù)熱過的1%淀粉溶液，反應(yīng)6 min后加入1.00 mL DNS溶液，并立即放入沸水中加熱5 min，加熱完畢后放入流水中冷卻至室溫，定容至25.00 mL，于540 nm處測(cè)吸光度值。試驗(yàn)以相同濃度阿卡波糖作陽性對(duì)照，繪制不同濃度抑制劑對(duì)α-淀粉酶活性的抑制曲線，用下式計(jì)算α-淀粉酶活性的抑制率：

(2)

式中：A1、A2、A3、A4分別是空白管、空白對(duì)照管、樣品管、背景對(duì)照管的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

2 結(jié)果與分析

2.1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由圖1可知，原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=2.63x+0.0394(R2=0.9991)，在0.05～0.30 mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，原花青素濃度與吸光值線性關(guān)系良好。

圖1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of proanthocyanidins

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素得率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素得率的影響見圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素得率的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on the yield of proanthocyanidins

由圖2可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在0%～40%范圍內(nèi)時(shí)，隨著乙醇濃度增大，原花青素得率增大；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到40%時(shí)，得率達(dá)到最高值，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的進(jìn)一步增大，原花青素得率開始下降。原花青素是一種多酚類化合物，含有較多酚羥基，因而具有一定極性，依據(jù)相似相溶的原理，當(dāng)溶劑極性和原花青素極性相當(dāng)時(shí)，溶解度達(dá)到最大，得率最高[14]。

2.2.2 提取溫度對(duì)原花青素得率的影響

提取溫度對(duì)原花青素得率的影響見圖3，圖中A和B分別為80 ℃和90 ℃提取液冷卻后的狀態(tài)。

由圖3可知，當(dāng)提取溫度在30～80 ℃范圍內(nèi)時(shí)，原花青素得率隨著溫度的升高而增大，80 ℃時(shí)達(dá)到最大值；超過80 ℃后，原花青素得率下降。溫度升高，會(huì)加速原花青素的溶出，但高溫同樣也能加快原花青素的氧化破壞[15]，最終，在80 ℃時(shí)得率達(dá)到最大值。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，80 ℃時(shí)提取液冷卻后會(huì)出現(xiàn)少量凝膠，90 ℃時(shí)則會(huì)出現(xiàn)大量凝膠。有研究表明，油茶果殼中含有較多膠類物質(zhì)[16]，此類物質(zhì)經(jīng)過高溫后冷卻會(huì)形成凝膠，由于這種不利反應(yīng)會(huì)影響后續(xù)的純化過程，所以選擇70 ℃作為最佳提取溫度。

圖3 提取溫度對(duì)原花青素得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of proanthocyanidins

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)原花青素得率的影響

提取時(shí)間對(duì)原花青素得率的影響見圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)原花青素得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of proanthocyanidins

由圖4可知，提取時(shí)間為2 min時(shí)就可以提取到很大部分的原花青素，并且隨著時(shí)間的增加，得率持續(xù)增大，到12 min時(shí)得率達(dá)到最大值，超過12 min后，原花青素得率下降。原因是隨著時(shí)間的增加，果殼中原花青素溶解越來越充分，得率增加，但時(shí)間過長(zhǎng)也會(huì)導(dǎo)致酚類物質(zhì)遭到破壞[17]，不利于原花青素的提取，因此選擇提取時(shí)間為12 min。此外，相比于從葡萄籽[18](提取時(shí)間為4 h)和板栗殼[19](提取時(shí)間為1.5 h)中提取原花青素，從油茶果殼中提取原花青素的時(shí)間很短，這可能與果殼材料特性有關(guān)，油茶果殼結(jié)構(gòu)呈多孔狀[20]，且易吸水膨脹，使果殼內(nèi)物質(zhì)容易與溶劑接觸并溶解，因此采用直接溶劑提取能夠在較短時(shí)間內(nèi)完成果殼中原花青素的提取。

2.2.4 料液比對(duì)原花青素得率的影響

料液比對(duì)原花青素得率的影響見圖5。

圖5 料液比對(duì)原花青素得率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on the yield of proanthocyanidins

由圖5可知，料液比在1∶10～1∶50 (g/mL)范圍內(nèi)時(shí)，原花青素得率隨著溶劑的增加而增加。增大溶劑量可以加大溶劑與物料的接觸面積[21]，使原花青素的得率增加，當(dāng)料液比為1∶40 (g/mL)后，部分與油茶果殼結(jié)合較緊密的原花青素已很難被提取出來，得率趨于穩(wěn)定。考慮得率和成本，選擇料液比為1∶40 (g/mL)。

2.2.5 提取次數(shù)對(duì)原花青素得率的影響

提取次數(shù)對(duì)原花青素得率的影響見圖6。

圖6 提取次數(shù)對(duì)原花青素得率的影響Fig.6 Effect of extraction times on the yield of proanthocyanidins

由圖6可知，提取2次時(shí)，原花青素得率顯著降低，提取3～5次時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)提取液中原花青素已經(jīng)很少，說明提取1次就能在很大程度上提取出果殼中的原花青素。綜合考慮能源消耗、材料成本，選擇提取次數(shù)為1次。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)原花青素得率影響較大的3個(gè)因素，即：乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間，分別以A，B，C表示，試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見表1。試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2，試驗(yàn)共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中4，7，10，14，17是中心試驗(yàn)，其余為析因試驗(yàn)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 The factors and levels of response surface test design

表2 響應(yīng)面分析結(jié)果Table 2 The results of response surface analysis

2.3.2 模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

采用Design-Expert 10對(duì)所得的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，分析結(jié)果見表3。由于各因素對(duì)原花青素得率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，為了明確各因子對(duì)響應(yīng)值的影響，對(duì)表2中原花青素得率進(jìn)行回歸擬合，獲得二次多項(xiàng)回歸方程：R1=5.410+0.056A+0.360B+0.120C+0.042AB+0.035AC-0.060BC-0.330A2-0.130B2- 0.190C2。

表3 回歸分析結(jié)果Table 3 The results of regression analysis

由表3可知，整體模型的P值<0.01，表明該二次方程模型達(dá)到極顯著水平。失擬項(xiàng)為0.30>0.05，表明該項(xiàng)不顯著，說明未知因素干擾很小。模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9907，校正決定系數(shù)RAdj2=0.9788，說明該模型對(duì)試驗(yàn)擬合較好，可以用于原花青素得率的理論值預(yù)測(cè)。乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、料液比的P值均小于0.05，說明各條件對(duì)原花青素得率均有顯著性影響。由F值可知，各因素對(duì)原花青素得率的影響次序?yàn)椋毫弦罕?提取時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.3.3 響應(yīng)面分析

使用Design-Expert 10軟件繪制得到等高線圖和響應(yīng)面圖(見圖7)，分別反映了乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取時(shí)間的交互作用。其中等高線圖呈圓形，表示交互作用不顯著，呈橢圓形則表示交互作用顯著[22]，由圖7可知，各因素等高線圖均接近圓形，表明各因素之間的交互作用不明顯。

圖7 各因素交互作用對(duì)原花青素得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour maps of the interaction of various factors on the yield of proanthocyanidins

2.3.4 提取條件的優(yōu)化及驗(yàn)證試驗(yàn)

結(jié)合回歸模型的數(shù)學(xué)分析可知，油茶果殼原花青素的最佳提取工藝參數(shù)為：提取時(shí)間13.27 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)43.12%，料液比1∶50(g/mL)。實(shí)際中，調(diào)整參數(shù)為：提取時(shí)間13 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)43%，料液比1∶50(g/mL)，在此工藝條件下油茶果殼原花青素的理論得率為5.64%。為檢驗(yàn)響應(yīng)面法的可靠性，采用最佳提取條件進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得的平均原花青素得率為5.58%，接近于理論預(yù)測(cè)值。此結(jié)果說明實(shí)際試驗(yàn)值與軟件預(yù)測(cè)值吻合度良好，證明此優(yōu)化方案可行。

2.4 原花青素對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用

原花青素對(duì)α-淀粉酶活性的抑制曲線見圖8。

圖8 油茶果殼原花青素對(duì)α-淀粉酶活性的抑制曲線Fig.8 Inhibition curves of proanthocyanidins from Camellia oleifera shell on α-amylase activity

由圖8可知，在0.08～1.50 mg/mL濃度范圍內(nèi)，原花青素對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率快速增加，超過1.5 mg/mL后，抑制率增加趨于平緩。周培羽等[23]研究了原花青素對(duì)α-淀粉酶的抑制作用及抑制機(jī)理，結(jié)果顯示：不同聚合度的原花青素均能夠插入α-淀粉酶的活性位點(diǎn)，占據(jù)催化中心，阻礙α-淀粉酶與底物的結(jié)合。當(dāng)原花青素濃度低于1.5 mg/mL時(shí)，α-淀粉酶的結(jié)合位點(diǎn)未飽和，抑制率快速升高；濃度超過1.5 mg/mL后，結(jié)合位點(diǎn)趨于飽和，抑制率緩慢增加。結(jié)果顯示：油茶果殼原花青素對(duì)α-淀粉酶的活性抑制呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系，當(dāng)濃度為2.00 mg/mL時(shí)，α-淀粉酶活性的抑制率達(dá)到79.64%，低于對(duì)照物阿卡波糖的92.06%。

分別對(duì)圖8中原花青素和阿卡波糖濃度和抑制率的關(guān)系進(jìn)行多元非線性擬合，計(jì)算得出原花青素的半抑制濃度為0.71 mg/mL，對(duì)照物阿卡波糖的半抑制濃度為0.30 mg/mL。原花青素粗提物對(duì)α-淀粉酶活性的抑制效果弱于阿卡波糖，可能是粗提物中含有較多雜質(zhì)，后期對(duì)原花青素的純化過程有利于進(jìn)一步提升抑制效果[24]。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化油茶果殼中原花青素的提取工藝，并探究原花青素對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用。結(jié)果顯示：油茶果殼中原花青素的最佳提取工藝條件為提取時(shí)間13 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)43%，料液比1∶50(g/mL)，原花青素含量達(dá)到極大值5.58%，與理論預(yù)測(cè)值接近。測(cè)定了不同濃度下原花青素對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用，抑制率可達(dá)到79.64%，半抑制濃度為0.71 mg/mL，表明油茶果殼原花青素具有較好的抑制α-淀粉酶活性效果，有望作為膳食添加劑應(yīng)用于血糖控制及糖尿病的防治。