李慧 鄒晨鑫 高靜 顏永剛 張崗 宋小妹 楊新杰

【摘 要】 目的：建立不同采收期珠子參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa、姜狀三七苷R1以及去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa 5種化學(xué)成分的含量測(cè)定方法。方法：采用Thermo C18 （5μm，4.6 mm×250 mm） 色譜柱;以0.02%的磷酸水溶液和乙腈進(jìn)行梯度洗脫;柱溫 30 ℃;流速1 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng) 203 nm。結(jié)果：不同采收期中5種化學(xué)成分含量積累在7月份達(dá)到最高。結(jié)論：7月份可作為珠子參最佳采收期，用于珠子參的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 珠子參;高效液相色譜法;皂苷類成分;不同采收期

【中圖分類號(hào)】R282 ? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A ? ?【文章編號(hào)】1007-8517（2021）12-0042-05

Abstract：Objective To establish a method for the determination of ginsenoside Rg1，ginsenoside Ro，chikusetsusaponin IVa，zingibroside R1 and deglucose chikusetsusaponin Ⅳ a in Panacis Majoris Rhizoma at different harvesting stages. Methods A Thermo C18 （5 μm，4.6 mm×250 mm） chromatographic column with gradient elution using 0.02% phosphoric acid aqueous solution and acetonitrile at 30 ℃ at a flow rate of 1 mL·min-1 and detection wavelength of 203 nm.Results The accumulation of the five chemical components in the different harvesting periods was highest in July.Conclusion The month of July can be used as the best harvesting period for quality control of Panacis Majoris Rhizoma.

Keywords：Panacis Majoris Rhizoma; High Performance Liquid Chromatography; Active Ingredient;Harvesting Time

珠子參Panacis Majoris Rhizoma（PMR）為五加科人參屬珠子參Panax japonicus C.A.Meg var.major （Burk.） C.Y.Wu et Feng ex C.Chow的干燥根莖，又名扣子七、珠兒參，主產(chǎn)于陜西、四川、云南、甘肅、寧夏、西藏等地，味苦、甘，性微寒，有滋陰養(yǎng)肺、止血活絡(luò)、益氣強(qiáng)身等功效[1]。珠子參根莖是主要的藥用部位，主要包含皂苷、多糖、黃酮、微量元素等，目前已經(jīng)從珠子參不同部位分離獲得多個(gè)單體皂苷，珠子參總皂苷具有一定的鎮(zhèn)痛抗炎[2]、增強(qiáng)免疫[3]、抗腫瘤[4-7]等活性。珠子參生長(zhǎng)緩慢成藥周期長(zhǎng)，多生長(zhǎng)于蔭蔽的林下等地，目前野生珠子參已處于極度瀕危狀態(tài)，對(duì)珠子參的研究也多為化學(xué)成分、藥理活性等，而栽培、資源分布等較少，因此合理規(guī)劃其采收期是極其重要的。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)5～7月不同采收期珠子參中5種化學(xué)成分含量變化，來(lái)確定珠子參最佳采收期。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695 高效液相色譜儀; GB204 型電子分析天平 （北京賽多利斯）; KQ-200KED 超聲波清洗機(jī) （江蘇昆山）; GZX- 9140MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱 （上海博迅）。

1.2 試藥 供試材料來(lái)源于陜西太白山種植基地，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為五加科植物珠子參Panax japonicus C.A.Meg var.major （Burk.） C.Y.Wu et Feng。人參皂苷Ro（批號(hào) 111903-201805）和人參皂苷Rg1（批號(hào)110703-201933）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，姜狀三七皂苷Rg1（批號(hào)B50413），竹節(jié)參Ⅳa（批號(hào)B21676），去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa（批號(hào)B24067）均購(gòu)于上海源葉公司。

1.人參皂苷Rg1;2.人參皂苷Ro;3.竹節(jié)參皂苷Ⅳa;4.姜狀三七皂苷R1;5.去葡萄糖竹節(jié)參Ⅳa

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備 珠子參根莖烘干，稱重，粉碎，取0.1 g，精密稱定，置于50 mL錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱重。超聲處理40 min（功率500 W，頻率40kHz），放至室溫，補(bǔ)足失量，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，待測(cè)。

2.2 混合對(duì)照品溶液制備 精密稱取各對(duì)照品適量，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用適量色譜甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，分別制成含人參皂苷Rg1 0.04 mg·mL-1、人參皂苷Ro 0.2 mg·mL-1、竹節(jié)參皂苷Ⅳa 0.25 mg·mL-1、姜狀三七皂苷R1 0.1 mg·mL-1、去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa 0.1 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，0.22 μm微孔濾膜濾過即得。

2.3 色譜條件 色譜柱為Thermo C18 （5 μm，4.6 mm × 250 mm） 色譜柱;流動(dòng)相為乙腈（A）-0.02%磷酸水（B），梯度洗脫（0～10 min： 5%～40%A; 10～22 min： 40%～75%A，22～34 min： 75%～90%A），檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，柱溫30℃，體積流量1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量為10 μL。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1、5、10、 15、20 μL，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，見表1。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液 10 μL，重復(fù)進(jìn)樣 5 次，測(cè)定峰面積，計(jì)算得人參皂苷Rg1、人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa、姜狀三七皂苷R1、去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa的RSD分別為1.3%、2.1%、2.5%、2.4%、1.1%。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批樣品（采收時(shí)間2019年6月1日）6份，按“2.1”項(xiàng)下方法制備，吸取10 μL 進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算得人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa、姜狀三七苷R1、去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa的RSD分別為2.4%、1.2%、2.3%、1.5%、2.1%，符合要求。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液（采收時(shí)間2019年6月1日），分別于配制后0、3、6、9、12、24 h 進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算得人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa、姜狀三七苷R1、去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa的RSD分別為1.2%、2.3%、2.1%、1.6%、1.5%。 結(jié)果表明，供試品溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批樣品（采收時(shí)間2019年6月1日）珠子參藥材0.1g，平行稱定6份。分別精密加入人參皂苷Rg1、人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa、姜狀三七苷R1、去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa對(duì)照品適量，按2.1項(xiàng)下方法制備成供試品溶液在上述色譜條件下測(cè)定，計(jì)算得到各成分平均加樣回收率為97.3～99.3%，RSD為1.8～2.5%，表明方法準(zhǔn)確度較好，結(jié)果見表2。

2.9 不同采樣時(shí)間中5中化學(xué)成分的含量測(cè)定 精密稱取不同批次樣品珠子參藥材粗粉0.1 g，每組重復(fù)6 次，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品，按“2.3”項(xiàng) 下條件進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果見表 3。5種成分從5月份開始含量積累逐步增加，直至7月份達(dá)到最大，隨后開始下降，其中人參皂苷Ro與竹節(jié)參皂苷Ⅳa最為顯著。

3 討論

中藥材有效成分含量對(duì)其質(zhì)量至關(guān)重要，直接影響藥材藥理活性[8]。靳維榮等[9]發(fā)現(xiàn)黃芩在9月份黃酮類含量最高，李雪營(yíng)等[10]發(fā)現(xiàn)不同采收期對(duì)黔產(chǎn)鴨跖草若也有顯著影響，研究表明7、8月采收最為適宜。

珠子參作為秦巴山區(qū)特色藥材之一，具有多種化學(xué)成分，不同時(shí)期的珠子參成分含量相差甚遠(yuǎn)。本實(shí)驗(yàn)首次建立HPLC法同時(shí)測(cè)定珠子參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa、姜狀三七皂苷R1和去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa 5種皂苷類成分含量的方法，結(jié)果顯示，5種皂苷類成分含量在不同時(shí)期的含量都存在明顯差異，隨著不同時(shí)期的采收可以看出5種皂苷類成分含量有明顯差異，5種皂苷類成分含量都在逐步增高，其中人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa含量始終最高，7月份采收含量顯著高于其它月份采收樣品，說(shuō)明珠子參適合夏末秋初采收，李淵源等[11]研究亦證實(shí)了這一點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與《陜西中草藥》[12]、15版《中國(guó)藥典》[1]中記載的珠子參采收期為“夏秋采挖”“秋季采收”有共同相似之處，為進(jìn)一步證明傳統(tǒng)采收時(shí)間的合理性提供了科學(xué)依據(jù)，但具體時(shí)間還需根據(jù)氣候條件等考慮。本實(shí)驗(yàn)只選取了5～8月份，且5種成分在7個(gè)時(shí)間點(diǎn)含量差距較大，分析原因可能是珠子參地上部分正在萌發(fā)從而導(dǎo)致根莖中的代謝產(chǎn)物質(zhì)量減小，此外除不同采收時(shí)間對(duì)含量有所影響，如土壤溫度、空氣溫度、濕度、光合有效輻射等生態(tài)因素的不同有效成分也會(huì)發(fā)生不同程度的變化[13-14]，氣候?qū)χ樽訁⒂行С煞址e累有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，經(jīng)方法學(xué)考察，本研究所建立的HPLC法線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性均良好，可用于同時(shí)測(cè)定不同采收期珠子參藥材中5種有效成分的含量。

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（收稿日期：2020-11-16 編輯：程鵬飛）