張娟 吳曉穎 許娜 杜沙沙 張彥 馬興華

摘 要：為研究油菜素內(nèi)酯（Brassinolide， BR）對煙草主莖生長的影響，利用外源2， 4-表油菜素內(nèi)酯（2， 4-Epibrassinolide， EBR），設(shè)置0.5×10-7 mol/L（T1）、0.5×10-5mol/L（T2）兩個(gè)濃度，以蒸餾水（CK）為對照對煙草幼苗進(jìn)行噴施。分析了不同處理的煙草幼苗株高，節(jié)距及解剖結(jié)構(gòu)特征，檢測了莖中與細(xì)胞分裂和細(xì)胞大小調(diào)控相關(guān)基因以及與油菜素內(nèi)酯（BR）、生長素（IAA）和赤霉素（GA）合成相關(guān)基因的表達(dá)量。結(jié)果表明，噴施EBR對煙草幼苗節(jié)距和株高有顯著促進(jìn)作用，并隨處理濃度升高，促進(jìn)作用增強(qiáng)。觀察石蠟切片發(fā)現(xiàn)EBR處理后莖皮層薄壁細(xì)胞數(shù)目增多，單細(xì)胞面積減小。EBR處理后，細(xì)胞周期調(diào)控基因NtCYCD3表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞大小調(diào)控基因NtARF6、NtARF16表達(dá)下調(diào);BR信號受體基因NtBRI1，NtBIN2表達(dá)上調(diào)，BR轉(zhuǎn)錄因子NtBES1T表達(dá)下調(diào);BR、IAA和GA的關(guān)鍵生物合成基因NtDWF4、NtYUCCA8、NtGA3ox-2表達(dá)量均上調(diào)。說明噴施EBR可促進(jìn)內(nèi)源BR、IAA和GA的合成基因表達(dá)，通過促進(jìn)節(jié)間細(xì)胞分裂、抑制細(xì)胞大小促進(jìn)煙草幼苗莖的生長。

關(guān)鍵詞：2， 4-表油菜素內(nèi)酯;煙草;莖伸長生長;解剖結(jié)構(gòu);基因表達(dá)量

Abstract： To study the effect of brassinolide （BR） on tobacco stem growth and elongation， the tobacco seedlings were treated with 2，4-epibrassinolide （EBR） of two different concentrations 0.5×10-7 mol/L （T1）， 0.5×10-5 mol/L （T2） and distilled water was used as control （CK）. Plant height， internode distance， and stem anatomical structure were analyzed. Genes related to cell division and cell size regulation， and genes related to biosynthesis of BR， auxin （IAA）， and gibberellin （GA） were also analyzed. The results showed that the application of EBR increased the seedling pitch and plant height， the promotion effect on stem growth was enhanced with increment of EBR concentrations. Stem anatomical study revealed an increase in the number of parenchyma cells and a decrease in its area after EBR treatment. EBR upregulated cell cycle-related gene NtCYCD3 while downregulated NtARF6 and NtARF16 genes that are related to cell size. Similarly， BR signaling receptor genes NtBRI1 and NtBIN2 were upregulated while the BR transcription factor NtBES1T was downregulated in response to EBR application. The expression of key biosynthesis genes NtDWF4， NtYUCCA8， and NtGA3ox-2 of BR， IAA， and GA， respectively， were all upregulated. The results showed that the application of EBR promoted the expression of endogenous BR， IAA and GA biosynthesis genes， and helped in the growth and elongation of tobacco seedling stem by promoting the division of internode cells and inhibiting cell expansion.

Keywords： 2， 4-epibrassinolide; Nicotiana tabacum; stem elongation; anatomical structure; gene expression;

莖是植物的三大營養(yǎng)器官之一，具有支持、運(yùn)輸、儲存、繁殖和光合的功能，在植物的生長發(fā)育過程中起著不可替代的作用[1]。株高是指植株主莖基部到頂部之間的距離，由植株的莖節(jié)數(shù)目和節(jié)間長度決定，是農(nóng)作物重要的生物學(xué)性狀之一，與作物經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量密切相關(guān)。適當(dāng)?shù)闹旮吣芸沟狗€有利于CO2的分布，提高光能利用率[2]。

植物株高的增長包括主莖節(jié)數(shù)的增多以及各節(jié)間的伸長[3]。細(xì)胞的分裂和伸長是植物莖伸長生長的主要原因，這一過程受多種內(nèi)外因素的調(diào)節(jié)和控制。油菜素內(nèi)酯（BR）是一種甾醇類植物激素，具有促進(jìn)生長、增加植物抗逆性、延緩衰老、促進(jìn)細(xì)胞再分化等功能，但最突出的生理作用就是促進(jìn)植物的生長[4]。BR對植物生長的促進(jìn)是通過促進(jìn)細(xì)胞分裂和伸長的作用實(shí)現(xiàn)的，并且這一促進(jìn)作用具有濃度效應(yīng)，多表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)高濃度抑制[5-6]。EBR是廣泛使用的一種人工合成油菜素內(nèi)酯，具有提高煙草抗旱性[7]，促進(jìn)十字花科植物幼苗和豌豆上胚軸細(xì)胞伸長[8]，誘導(dǎo)水稻節(jié)間伸長[9]的功能。

株高是與烤煙產(chǎn)值關(guān)系最密切的因素之一，煙草株高通過影響煙株有效葉數(shù)、葉長、葉寬而間接影響煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)[10-11]。而目前關(guān)于施用植物生長調(diào)節(jié)劑對煙草莖伸長生長的研究報(bào)道尚少;施用BR如何影響煙草主莖伸長，是否會影響GA、IAA含量及其合成基因的表達(dá)等尚未見報(bào)道。因此本研究通過噴施不同濃度EBR，從生物學(xué)性狀，莖細(xì)胞解剖學(xué)特征，控制細(xì)胞分裂和大小的關(guān)鍵基因、BR信號通路基因和內(nèi)源激素合成相關(guān)基因表達(dá)量等方面分析其對煙草莖伸長生長的影響，進(jìn)一步闡述外源植物生長調(diào)節(jié)劑在調(diào)控?zé)煵萸o生長中的作用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種為普通煙草K326，由國家農(nóng)作物種質(zhì)資源平臺煙草種質(zhì)資源子平臺提供，2，4-表油菜素內(nèi)酯購于索萊寶生物有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所即墨試驗(yàn)基地進(jìn)行。共設(shè)置0.5×10-7 mol/L（T1）、0.5×10-5 mol/L（T2）兩個(gè)濃度，以蒸餾水（CK）為對照。育苗基質(zhì)（泥炭和蛭石比例為1∶1）經(jīng)120 ℃滅菌20 min后裝盆，種子直接播種于規(guī)格為5 cm×5 cm×7 cm的黑色塑料花盆中并于種子萌發(fā)一周后間苗，每盆保留一棵幼苗，每個(gè)處理30盆。當(dāng)煙苗生長至4葉1心時(shí)，選出長勢均勻一致的煙苗，每天于15：00噴施1次，葉片正面均勻噴施，噴至葉片上形成均勻的液滴為止，連續(xù)噴施5 d。

1.3 測定方法

1.3.1 煙草主莖生物學(xué)性狀調(diào)查 噴施EBR處理5 d后，每個(gè)處理選長勢均勻一致的植株10株，去除葉片和根系后留主莖拍照，用Image J軟件測量株高（根莖結(jié)合處到心葉葉柄著生處的距離）和節(jié)距（自下而上第5節(jié)節(jié)距）。

1.3.2 莖細(xì)胞解剖學(xué)特征觀察 取第5片真葉葉柄著生處1 cm長的莖組織，用FAA固定液（含5%醋酸，70%乙醇和5%甲醛，體積分?jǐn)?shù)）固定，然后經(jīng)乙醇逐級脫水，石蠟包埋，切割成5 μm薄片，甲苯胺藍(lán)染色，明膠封片后于光學(xué)顯微鏡（Leica DMC 2900，上海徠卡儀器有限公司）下觀察皮層薄壁細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞數(shù)目，用Image J軟件計(jì)算細(xì)胞面積。

1.3.3 RNA提取和qRT-PCR 參考已發(fā)表的擬南芥的基因序列，在NCBI網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm. nih.gov/）中搜索獲得BR、IAA、GA合成與轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因以及與細(xì)胞大小、細(xì)胞分裂相關(guān)基因的序列（表1）。

2 結(jié) 果

2.1 噴施EBR對煙草幼苗生物學(xué)性狀的影響

不同濃度EBR處理下煙苗主莖見圖1，EBR葉面噴施5 d后觀察莖的生物學(xué)性狀發(fā)現(xiàn)（圖2），EBR濃度越高，煙草幼苗株高越高，T1、T2較CK分別增加17.8%和23.13%。同時(shí)測量了自下而上第五節(jié)節(jié)距，發(fā)現(xiàn)節(jié)距也隨著EBR濃度升高而增大，T1、T2較CK分別增加7.35%和32.35%。不同濃度EBR處理下葉片數(shù)沒有顯著差異。結(jié)果表明在本試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，EBR具有促進(jìn)主莖伸長的作用。

2.2 噴施EBR對煙草皮層薄壁細(xì)胞的影響

EBR處理5 d后觀察第5片真葉葉柄著生處莖的縱切面（圖3），用Image J軟件測量皮層薄壁細(xì)胞面積發(fā)現(xiàn)，EBR處理后皮層薄壁細(xì)胞面積較CK顯著減小，而T1和T2處理間細(xì)胞面積無顯著性差異。其中T1處理下皮層薄壁細(xì)胞面積為36.46 μm2，比CK（51.19 μm2）減小28.39%，T2處理下皮層薄壁細(xì)胞面積為35.16 μm2，比CK減小31.53%。雖然細(xì)胞面積減小，但是T1、T2處理下單位面積內(nèi)細(xì)胞數(shù)目顯著增加，其中T1處理下外皮層單位面積內(nèi)細(xì)胞數(shù)目為1 325.67個(gè)/mm2，比CK（734.37 個(gè)/mm2）增加80.52%;T2處理下外皮層單位面積內(nèi)細(xì)胞數(shù)目為1 267.27個(gè)/mm2，比CK增加73.02%。說明EBR處理使細(xì)胞數(shù)目增多，細(xì)胞面積減小。

2.3 噴施EBR對基因表達(dá)量的影響

不同濃度EBR處理24 h后，BR、IAA、GA相關(guān)基因和細(xì)胞分裂、細(xì)胞大小調(diào)控基因表達(dá)量如圖4-6所示。由圖4可見，T2處理細(xì)胞周期蛋白基因NtCYCD3表達(dá)量較CK增加105.2%。T1處理細(xì)胞大小調(diào)控基因NtARF6表達(dá)量較CK下降75.9%，T2處理較CK下降60.9%。T1處理細(xì)胞大小調(diào)控基因NtARF16表達(dá)量較CK下降39.4%，T2處理較CK下降23.9%?？梢奅BR處理促進(jìn)了細(xì)胞分裂基因的表達(dá)，抑制了細(xì)胞大小調(diào)控基因的表達(dá)。

由圖5可見，T2處理BR受體基因NtBR11表達(dá)量較CK增加234.1%，NtBIN2表達(dá)量較CK增加71.22%。T1處理BR信號轉(zhuǎn)錄因子NtBES1T的表達(dá)量較CK下降71.5%，T2處理較CK下降95.9%。由圖6可見，T2處理BR合成基因NtDWF4表達(dá)量較CK提高105.5%，IAA生物合成基因NtYUCCA8表達(dá)量較CK增加36.3%。T1處理GA生物合成基因NtGA3ox-2表達(dá)量較CK增加116.3%，T2處理增加162.4%。EBR處理后BR、IAA、GA合成基因表達(dá)量均增加，對應(yīng)受體基因表達(dá)量增加，轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量下降。說明EBR處理促進(jìn)細(xì)胞分裂和BR、IAA、GA的合成。

3 討 論

BR通過激活細(xì)胞分裂、促進(jìn)細(xì)胞伸長而促進(jìn)節(jié)間伸長[4-5]。在本試驗(yàn)中，不同濃度EBR處理后煙草幼苗主莖均顯著伸長，葉片數(shù)無顯著差異，節(jié)距顯著增大，細(xì)胞數(shù)目增多（圖1），因此EBR可能是通過促進(jìn)節(jié)距增加而促進(jìn)主莖伸長。細(xì)胞周期蛋白基因CYCD3具有通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖影響植株葉形和細(xì)胞數(shù)目的作用[18]，研究證明EBR促進(jìn)AtCYCD3的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)細(xì)胞分裂[19]。本研究檢測了莖中NtCYCD3的表達(dá)量，結(jié)果顯示在T2處理下其表達(dá)量顯著增加，說明NtCYCD3參與了EBR調(diào)控主莖伸長的過程。BR可使細(xì)胞壁松弛，促使細(xì)胞攝入水分而產(chǎn)生機(jī)械膨大[8]。本試驗(yàn)中細(xì)胞并未膨大而是出現(xiàn)了面積減小的現(xiàn)象，這一現(xiàn)象出現(xiàn)的原因有待進(jìn)一步研究。NtARF6和NtARF16能調(diào)控細(xì)胞分裂和細(xì)胞大小，NtARF16基因過表達(dá)擬南芥葉片的細(xì)胞面積顯著增大[14]。本研究發(fā)現(xiàn)EBR處理后NtARF6和NtARF16在莖中的表達(dá)量下降，細(xì)胞面積減小。以上結(jié)果從轉(zhuǎn)錄水平解釋了BR通過促進(jìn)細(xì)胞分裂，增加細(xì)胞數(shù)量進(jìn)而促進(jìn)莖伸長生長。

在BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，細(xì)胞膜外受體激酶BRI1與BR結(jié)合后，使BKI1磷酸化，同時(shí)BIN2被磷酸酶BRI1-SUPPRESSO1（BSU1）脫磷酸化并被降解，抑制了BES1/BZR1的表達(dá)[20-21]。之后，BR通過調(diào)節(jié)編碼XET基因的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞壁的松弛，減小壁壓，降低水勢，使水分和養(yǎng)分進(jìn)入細(xì)胞，促使細(xì)胞擴(kuò)大[8]。在本試驗(yàn)中，T2處理中BR促進(jìn)了NtBRI1和NtBIN2在莖上部的表達(dá)，在T1和T2處理中BR抑制了NtBES1T的表達(dá)。而T1濃度處理下BR的促進(jìn)效應(yīng)并不顯著，可能是因?yàn)闊煵葜髑o對低濃度BR并不敏感。這些結(jié)論說明EBR處理可以提高BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活BR反應(yīng)。

BRs合成酶DWF4是BR合成關(guān)鍵酶[22]，DWF4的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與有活性的BR含量呈正相關(guān)[23]。擬南芥中，YUCCA能催化吲哚-3-丙酮酸（IPyA）氧化脫羧過程中的不可逆限速步驟，形成IAA[24]。研究表明，BR調(diào)節(jié)GA生物合成以調(diào)節(jié)細(xì)胞伸長[25]。通過分析BR突變體，發(fā)現(xiàn)GA含量以及GA代謝基因（包括GA20ox-2，GA3ox-2和GA2ox-3）的表達(dá)與BR含量相關(guān)[26]。本研究通過對BR、IAA和GA的合成基因進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)EBR處理除了誘導(dǎo)BR合成關(guān)鍵基因NtDWF4表達(dá)上調(diào)外，還促進(jìn)了植物IAA生物合成基因NtYUCCA8和GA生物合成基因NtGA3ox-2的表達(dá)（圖5），而且IAA的合成和應(yīng)答反應(yīng)對高濃度的EBR響應(yīng)敏感。相較于IAA，GA對BR的反應(yīng)似乎更為敏感，NtGA3ox-2的表達(dá)量在T1濃度處理下就已顯著升高，在T2濃度處理下表達(dá)量變化較T1更加顯著。這也充分說明BR可影響內(nèi)源激素的合成。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)結(jié)果表明，噴施0.5×10-7 和0.5×10-5 mol/L EBR使煙草幼苗節(jié)距和株高增加，并且隨濃度升高增加效應(yīng)增大。EBR通過促進(jìn)細(xì)胞分裂進(jìn)而促進(jìn)莖的伸長。EBR處理后莖皮層薄壁細(xì)胞數(shù)目增多，細(xì)胞分裂基因表達(dá)量增加;細(xì)胞面積減小，細(xì)胞大小調(diào)控基因表達(dá)量下降。同時(shí)，噴施EBR會促進(jìn)內(nèi)源BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因和BR、IAA、GA合成基因的表達(dá)。

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