王大會 蔣承耿 王忠宇 龍友華 樊榮 莫飛旭 石金巧

摘 要：為明確在貴州省六盤水市煙區(qū)發(fā)生的一種煙草細菌性葉枯病的病原并篩選出防治藥劑，本研究通過組織分離法分離病原菌，結(jié)合形態(tài)學鑒定、柯赫氏法則和分子生物學等方法鑒定病原菌，并初步研究該菌的生理生化特性，采用抑菌圈法測定15種殺菌劑對該病原菌的毒力。結(jié)果表明，該病害病原菌與成團泛菌（Pantoea agglomerans）同源性達100%，為革蘭氏陰性菌，可利用D-阿拉伯糖、丙三醇和硝酸鹽等碳氮源;室內(nèi)防治藥劑篩選試驗表明，1.6%噻霉酮EW、3%中生菌素WP和80%乙蒜素EC對該菌有較好的抑菌效果，EC50值分別為0.004、0.0135和0.1176 mg/mL。試驗表明，該煙草細菌性葉枯病致病菌為成團泛菌（Pantoea agglomerans），1.6%噻霉酮EW可作為防治該病害的有效藥劑。

關(guān)鍵詞：煙草;葉枯病;成團泛菌;病原鑒定;藥劑篩選

Abstract： In order to identify the pathogen of bacterial leaf blight in Liupanshui City， Guizhou Province and screen for control agents， in this study pathogenic bacteria were isolated by tissue separation. In combination with morphological identification， Koch's rule and molecular biology approaches， physiological and biochemical characteristics of the bacteria were preliminarily studied. The toxicity of 15 fungicides to the pathogen was determined by the bacteriostasis method. The results showed that the pathogen has 100% homologous with Pantoea agglomerans， a gram-negative bacterium， which can use carbon and nitrogen sources such as D- arabinose， propanol and peptone. The screening test of indoor control agents showed that 1.6% Thiamphenone EW， 3% Zhongshengmycin WP and 80% Ethylicin EC had good antibacterial effects on the bacteria. The EC50 values were 0.004 mg/mL， 0.0135 mg/mL and 0.1176 mg/mL respectively. The tests showed that the bacterial leaf blight pathogen of tobacco was Pantoea agglomerans. 1.6% thiamethoxone EW can be used as an effective agent to control the disease.

Keywords： tobacco; leaf blight; pantoea agglomerans; pathogen identification; pesticide screening

煙草（Nicotiana tabacum L.）是我國重要的經(jīng)濟作物之一[1-2]，煙草病害是制約煙草生產(chǎn)的重要因素。目前已報道的煙草侵染性病害有60余種[3]，其中常見的葉部病害包括由毀滅炭疽菌（Colletotrichum destructivum）、鏈格孢菌[Alter aria alternata （Fries）]、二孢白粉菌（Erysiphe cichoracearum）]等真菌引起的煙葉炭疽病、赤星病、白粉病等[4-6]，由煙草假單胞桿菌（Pseudomonas syringae pv. Tabaci）、丁香假單胞桿菌角斑?；蚚Pseudomonas syringae pv.Angulata （Fromeetal） Holland]、青枯雷爾氏桿菌（Rastonia solanacearum）等細菌引起的野火病、角斑病及青枯病等[7-9]，以及由TMV、CMV、PVY等引起的煙草病毒病[10]。與之前報道的所有病害均不相同，2011年在貴州省六盤水市保田鎮(zhèn)煙區(qū)零星發(fā)生一種煙草葉部病害，可引起煙株中下部葉片腐爛，通過室內(nèi)保溫保濕培養(yǎng)可觀察到病部產(chǎn)生菌膿，因此初步判斷該病害為細菌性病害。2018年該病害發(fā)生面積達66.67 hm2，重病田塊病株率達100%，發(fā)病區(qū)域造成的平均經(jīng)濟損失達23.1%，嚴重損害了煙草的經(jīng)濟效益。

為明確該病害的病原，探索防控措施，本研究從發(fā)病煙葉中分離病原菌，采用柯赫氏法則、生理生化特性、分子生物學明確病原菌種類，通過室內(nèi)毒力測定篩選有效的防控藥劑，以期為該病害的診斷與防治提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料及藥劑

1.1.1 病樣采集 2018年8月在貴州省六盤水市保田煙區(qū)采集感病葉片，裝入采樣袋，做好標記后4 ℃冷藏備用。

1.1.2 供試藥劑 15種供試藥劑種類及生產(chǎn)廠家見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌分離純化 采用常規(guī)組織分離法分離病原菌[11]。取樣本病健交界處5 mm×5 mm組織塊在75%酒精浸泡5 s，無菌水漂洗3次后置于滅菌研缽中，加入兩滴無菌水進行研磨，充分研磨后用接種針蘸取少量菌液在NA平板劃線，封口后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h;挑取典型單菌落進一步純化，純化2～3次;挑取純化后的單菌落于NB培養(yǎng)基中，在25 ℃恒溫振蕩器培養(yǎng)24 h，用移液槍取1 mL菌懸液與1 mL 30%滅菌甘油，置于冷存管中于?80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 致病性測定 根據(jù)柯赫氏法則進行致病性測定。挑取單菌落混入NB培養(yǎng)液中，置于25 ℃恒溫振蕩箱培養(yǎng)24～48 h并將其稀釋為1×106 cfu/g菌懸液備用。采用創(chuàng)傷接種法分別對離體煙葉和盆栽煙株進行接種，離體煙葉選取煙草中下部健康葉片，用70%酒精進行表面消毒，無菌水清洗3次晾干并刺傷，用菌懸液噴淋刺傷部位后裝入自封袋內(nèi)，置于人工氣候箱（28 ℃，RH 75%）培養(yǎng);盆栽煙株選取中下部葉片、葉柄基部進行接種，接種方式與離體煙葉相同。均以滅菌后的NB培養(yǎng)液作為空白對照，觀察并記錄發(fā)病情況，在發(fā)病后比對田間病害癥狀與回接產(chǎn)生的癥狀是否一致，并再次進行分離純化，與接種菌株進行比對。

1.2.3 病原菌形態(tài)學鑒定 電鏡觀察菌體形態(tài)[12]，并將病原菌接種在NA平板培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h完成病原菌的活化，觀察記錄菌落顏色、形態(tài)特征;挑取單菌落接入NB培養(yǎng)液置于28 ℃恒溫振蕩箱培養(yǎng)72 h，觀察記錄細菌懸液渾濁程度、是否沉淀、是否結(jié)膜、有無氣泡;選取健康的薯塊用1%次氯酸鈉溶液浸泡24 h，采用刺傷接種法將菌懸液噴灑在薯塊上，觀察記錄菌落生長形態(tài)以及薯塊顏色變化情況。

1.2.4 病原菌分子生物學鑒定 首先活化病原菌，具體方法同1.2.3，待長出單菌落后將平板送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行分子生物學鑒定，通用引物為細菌7F/1540R序列，PCR長度1500 bp左右。

1.2.5 病原菌生理生化特性試驗 參照《伯杰細菌鑒定手冊》[13]和《植物病原細菌鑒定實驗指導》[14]進行病原菌生理生化特性測定。測定革蘭氏反應(yīng)、熒光檢測、碳源利用（海藻糖、山梨醇、D-阿拉伯糖、丙三醇、丙二酸鹽）、氮源利用（甘露醇、硝酸還原）、葡萄糖氧化發(fā)酵、淀粉水解、接觸酶、氧化酶、M-R、V-P、七葉靈水解、明膠液化、吲哚的產(chǎn)生、YDC培養(yǎng)基上色素的產(chǎn)生等14項生理生化測定指標，3個重復，另設(shè)空白對照。

1.2.6 供試藥劑的抑菌試驗 采用濾紙片法測定病原菌對供試藥劑的敏感性[15]。用接種針挑取培養(yǎng)24 h的病原菌置于NB培養(yǎng)基，恒溫振蕩培養(yǎng)24～48 h制成菌懸液備用;利用試管將藥劑按推薦用量稀釋成5個濃度梯度，以無菌水作為對照，將直徑0.6 cm的滅菌濾紙片放于試管中浸泡1 h制成含藥濾紙片;用移液槍量取500 μL菌懸液加入已冷卻至45 ℃的NA培養(yǎng)基中，混勻后倒入培養(yǎng)皿，制成含菌平板，用鑷子夾取含藥濾紙片放于培養(yǎng)基中央封口，每個處理3個重復，做好標記后利用封口膜密封，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑，計算相對抑制率和EC50。

2 結(jié) 果

2.1 病原菌的分離與致病性測定

從田間采集的發(fā)病樣本中分離得到的微生物，經(jīng)進一步純化得到3個菌株，編號分別為PXH-1、PXH-2、PXH-3，對3個菌株進行致病性測定，結(jié)果顯示編號為PXH-1菌株回接離體葉片與盆栽煙株均出現(xiàn)感病癥狀（圖1B、D），發(fā)病初期葉片主要產(chǎn)生淡黃色橢圓形斑點，病斑初期產(chǎn)生褪綠小點，后期逐漸擴大為圓形褐色水漬斑，并伴有黃色暈圈。從回接發(fā)病葉片上均分離得到與PXH-1形態(tài)特征一致的菌株，故確定PXH-1菌株為引起該細菌性病害的病原菌。

2.2 病原菌的形態(tài)學觀察與生理生化測定

分離得到的PXH-1菌體呈直桿狀，大小在（376～409）×（702～974） nm，為革蘭氏陰性菌（圖2A）;菌體在紫外燈下不產(chǎn)生熒光反應(yīng)（圖2B）;在NA培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h出現(xiàn)乳白色圓形菌落（圖2C）;表面光滑無流動性，培養(yǎng)48 h產(chǎn)生黃色色素，呈現(xiàn)乳黃色圓形菌落并伴臭味（圖2D）;在NB培養(yǎng)基中生長良好，渾濁、有氣泡且產(chǎn)生絮狀沉淀;在馬鈴薯薯塊上生長良好不易擴散，菌體呈乳黃色，薯塊變褐色（圖2E）。生理生化測定結(jié)果顯示（表2），該致病菌在YDC培養(yǎng)基上不產(chǎn)生褐色素，淀粉水解、七葉靈水解、明膠水解結(jié)果呈陽性，接觸酶、氧化酶測定結(jié)果為陰性，在有氧無氧條件下均可分解葡萄糖，可利用D-阿拉伯糖、丙二酸鹽、丙三醇、海藻糖、山梨醇和甘露醇。根據(jù)以上形態(tài)學觀察及相關(guān)生理生化測定結(jié)果，初步判定該菌與成團泛菌（P. agglomerans）相似[13]。

2.3 病原菌的分子生物學鑒定

用細菌通用引物7F/1540R擴增得到該細菌的16S rDNA序列，長1409 bp，在NCBI進行BLAST比對，結(jié)果與成團泛菌（P. agglomerans）同源性達100%。在GenBank數(shù)據(jù)庫中下載近緣序列，以P. fluorescens為外群，通過軟件MEGA 7.0，采用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，PXH-1菌株與P. agglomerans在自舉值98%水平聚類于同一分支（圖3），最終確定煙草細菌性病害病原菌為泛菌屬的成團泛菌（P. agglomerans）。

2.4 病原菌室內(nèi)藥劑篩選

通過室內(nèi)藥劑篩選發(fā)現(xiàn)（表3），37.0%苯醚甲環(huán)唑WP、1.6%噻霉酮EW、3.0%中生菌素WP、80.0%乙蒜素EC這4種殺菌劑對病原菌均有抑制作用，其他11種藥劑均無抑菌效果。有抑菌作用的4種不同殺菌劑之間EC50相差較大，其中防治效果最好的是1.6%噻霉酮EW，EC50為0.004 mg/mL，其次為3.0%中生菌素WP、80.0%乙蒜素EC，EC50分別為0.013 5 mg/mL、0.117 6 mg/mL，37.0%苯醚甲環(huán)唑WP抑菌效果較差，EC50為27.160 0 mg/mL。

3 討 論

本試驗明確了發(fā)生于貴州省六盤水市的細菌性病害病原為成團泛菌（Pantoea agglomerans），屬于腸桿菌目腸桿菌科泛菌屬（Pantoea）[16]。成團泛菌是泛菌屬（Pantoea）的模式菌，一般與植物相關(guān)，可腐生、內(nèi)生或作為病原體，存在于植物、動物以及水、土壤中[17]。國內(nèi)外報道P. agglomerans可侵染多種植物，如玉米（Zea mays）[18]、楊樹（Populus L.）[19]、核桃（Juglans regia）[20]、棉花（Gossypium spp）[21]、大白菜（Brassica rapapekinensis）[22]、水稻（Oryza sativa L.）[23]等，可見P. agglomerans的寄主范圍廣泛，因此在P. agglomerans引起的煙草細菌性葉枯病發(fā)生田間不適宜與以上作物輪作。

在防治藥劑篩選中，嚴婉榮等[24]對火龍果細菌性腐爛病菌（P. agglomerans）篩選出53.8%氫氧化銅WG、47%春雷·王酮WP、72%農(nóng)用鏈霉素SP、2%春雷霉素AS4種防治藥劑，并進行田間藥效試驗，53.8%氫氧化銅WG 1000倍液處理的防效能達到70%以上;郭安柱等[25]對核桃黑斑病菌（P. agglomerans）篩選出4種防治藥劑并進行田間藥效試驗，防效均達到70%以上，表明中生菌素、噻霉酮、氟啶胺和春雷霉素等藥劑對P. agglomerans引起的植物病害具有良好的防控效果。本試驗中煙草細菌性葉枯病的田間防控即參考以上藥劑。此外，試驗通過測定15種殺菌劑對P. agglomerans的毒力，發(fā)現(xiàn)37%苯醚甲環(huán)唑WP、1.6%噻霉酮EW、3%中生菌素WP、80%乙蒜素EC對該菌均表現(xiàn)出抑制作用，但并未進行田間藥效試驗，需進一步驗證。

試驗組在前期的田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該煙草細菌性葉枯病在六盤水煙區(qū)的發(fā)生時間集中在7月中旬至8月上旬，該時段多為高溫，降水量較大的時期，表明高溫高濕條件可能有利于該病害的發(fā)生。

4 結(jié) 論

本試驗通過分離與鑒定，明確了引起六盤水市煙草細菌性葉枯病的病原為成團泛菌（Pantoea agglomerans），該病原菌引起煙草葉部病害系首次報道。室內(nèi)毒力測定結(jié)果表明，1.6%噻霉酮EW、3.0%中生菌素WP和80.0%乙蒜素EC對該病原菌具有較好的抑菌作用。

參考文獻

[1]陳麗鵑，周冀衡，李強，等. 鎘對煙草的毒害及煙草抗鎘機理研究進展[J]. 中國煙草科學，2014，35（6）：93-97.

CHEN L J， ZHOU J H， LI Q， et al. Advance in cadmium toxicity to tobacco and its resistance mechanism[J]. Chinese Tobacco Science， 2014， 35（6）： 93-97.

[2]任民，王志德，牟建民，等. 我國煙草種質(zhì)資源的種類與分布概況[J]. 中國煙草科學，2009，30（S1）：8-14.

REN M， WANG Z D， MOU J M， et al. Overview of species and distribution of tobacco germplasm resources in China[J]. Chinese Tobacco Science， 2009， 30（S1）： 8-14.

[3]陳瑞泰，朱賢朝，王智發(fā)，等. 全國16個主產(chǎn)煙省（區(qū)）煙草侵染性病害調(diào)研報告[J]. 中國煙草科學，1997，l（4）：1-7.

CHEN R T， ZHU X C， WANG Z F， et al. A survey report on tobacco Infection and venereal diseases in 16 major tobacco producing provinces （regions）[J]. Chinese Tobacco Science， 1997， 1（4）： 1-7.

[4]田華，朱艷梅，董瑜，等. 毀滅炭疽菌Colletotrichum destructivum誘抗蛋白對煙草抗病性的誘導[J]. 植物保護學報，2017，44（1）：67-74.

TIAN H， ZHU Y M， DONG Y， et al. Induced resistance of tobacco by the protein elicitor of colletotrichum destructivum[J]. Journal of Plant Protection， 2017， 44（1）： 67-74.

[5]朱承廣，任民，蔣彩虹，等. 以關(guān)聯(lián)分析發(fā)掘煙草抗赤星病基因分子標記[J]. 中國煙草科學，2017，38（1）：68-72.

ZHU C G， REN M， JIANG C H， et al. Identification of molecular markers for tobacco brown spot resistant genes through association analysis[J]. Chinese Tobacco Science， 2017， 38（1）： 68-72.

[6]焦蓉，何鵬飛，王戈，等. 內(nèi)生菌YN201728的定殖能力及其防治煙草白粉病的效果研究[J]. 核農(nóng)學報，2020，34（4）：721-728.

JIAO R， HE P F， WANG G， et al. Colonization and control effect on tobacco powdery mildew of endophyte YN201728[J]. Journal of Nuclear Agriculture， 2020， 34（4）： 721-728.

[7]魏代福，譚青濤，張廣民. 防治煙草野火病的藥劑測定與篩選[J]. 中國煙草科學，2010，31（2）：42-44.

WEI D F， TANG Q T， ZHANG G M. Determination and selection of pesticides against tobacco wildfire disease （Pseudomonas syringae pv.tabaci）[J]. Chinese Tobacco Science， 2010， 31（2）： 42-44.

[8]孫劍萍，文景芝，孫宏偉，等. 黑龍江省煙草角斑病菌菌系分化研究[J]. 中國煙草科學，2014，35（3）：46-49.

SUN J P， WEN J Z， SUN H W， et al. Physiological races of genetic differentiation of tobacco angle spot pathogenic bacteria in Heilongjiang province[J]. Chinese Tobacco Science， 2014， 35（3）： 46-49.

[9]段燕平，梁梅，秦西云. 云南保山煙草青枯病的病原鑒定及發(fā)生規(guī)律[J]. 中國煙草科學，2008，29（5）：48-51.

DUAN Y P， LIANG M， QIN X Y. Pathogen identification of Ralstonia solanacearum E. F Smith on tobacco and its occurrence in Baoshan[J]. Chinese Tobacco Science， 2008， 29（5）： 48-51.

[10]董鵬，朱三榮，蔡海林，等. 湖南煙草病毒病種類檢測與系統(tǒng)進化分析[J]. 中國煙草科學，2020，41（3）：58-64.

DONG P， ZHU S R， CAI H L， et al. Detection and phylogenetic analysis of tobacco viruses in Hunan province[J]. Chinese Tobacco Science， 2020， 41（3）： 58-64.

[11]方振東. 植物病理學研究方法[M]. 3卷. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：165-211.

FANG Z D. Plant pathology research methods[M]. 3rd Ed. Beijing： China Agriculture Press， 1998： 165-211.

[12]胡春輝，徐青，孫璇，等. 幾種典型掃描電鏡生物樣本制備[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學，2016，55（20）：5389-5392，5402.

HU C H， XU Q， SUN X， et al. Several biological typical samples preparation methods of scanning electron microscope[J]. Hubei Agricultural Science， 2016， 55（20）： 5389-5392， 5402.

[13]R.E.布坎南，N.E.吉本斯. 伯杰細菌鑒定手冊[M]. 第八版. 北京：科學出版社，1984.

[14]SCHAAD N W，張克勤. 植物病原細菌鑒定實驗指南[M]. 貴州：貴州人民出版社，1986.

SCHAAD N W， ZHANG K Q. Experimental guidelines for identification of plant pathogenic bacteria[M]. Guizhou： Guizhou People Press， 1986.

[15]譚才鄧，朱美娟，杜淑霞，等. 抑菌試驗中抑菌圈法的比較研究[J]. 食品工業(yè)，2016（11）：122-125.

TAN C D， ZHUM J， DU S X， et al. Comparative study of bacteriostatic circle method in bacteriostatic test[J]. Food Industry， 2016（11）： 122-125.

[16]彭煒. 植物細菌性病害和病原細菌分類研究進展[C]//中國植物保護學會. 公共植保與綠色防控. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學技術(shù)出版社，2010：166-175.

PENG W. Research progress on classification of plant bacterial diseases and pathogenic bacteria[C]//China Society of Plant Protection. Public Plant Protection and Green Prevention and Control. Beijing： China Agricultural Science and Technology Press， 2010： 166-175.

[17]趙耘霄. 危害核桃的成團泛菌及其系統(tǒng)進化分析[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學，2016.

ZHAO Y X. Identification and phylogenetic analysis of walnut-associated Pantoea agglomerans[D]. Tai'an： Shandong Agricultural University， 2016.

[18]曹慧英. 玉米新病害—細菌干莖腐病的研究[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2010.

CAO H Y. Bacterial dry stalk rot in maize， a new disease[D]. Beijing： Chinese Academy of Agricultural Sciences， 2010.

[19]保善存，夏吾拉太，殷光晶，等. 楊樹枝干病害病原物分離與鑒定[J/OL]. 分子植物育種：1-11[2020-07-23]. http：//kns.cnki.net/ kcms/detail/46.1068.S.20200720.0955.004.html.

BAO S C， XIA L T， YIN G J， et al. Isolation and identification of pathogens of poplar stem diseases[J/OL]. Molecular Plant Breeding： 1-11[2020-07-23]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S. 20200720.0955.004.html.

[20]李君，韓穎，趙寧，等. 云南31個核桃品種對黑斑病的抗病性評價[J]. 中國植保導刊，2020，40（1）：67-71.

LI J， HAN Y， ZHAO N， et al. Resistance evaluation of 31 walnut cultivars against bacterial black spot disease in Yunnan province[J]. China Plant Protection Guide， 2020， 40（1）： 67-71.

[21]劉雅琴，楊麗，李國英，等. 成團泛菌引起的棉花爛鈴病對棉花產(chǎn)量因子和品質(zhì)的影響[J]. 植物保護，2008（5）：103-106.

LIU Y Q， YANG L， LI G Y， et al. Effects of cotton boll rot caused by Pantoea agglomerans on cotton traits and yield[J]. Plant Protection， 2008（5）： 103-106.

[22]郭萌. 大白菜軟腐病新病原菌Pantoea agglomerans鑒定及抗性鑒定方法[D]. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學，2019.

GUO M. Identification of new pathogens of chinese cabbage soft rot and resistant identification method[D]. Harbin： Northeast Agricultural University， 2019.

[23]洪永聰，胡方平，黃曉南. 成團泛菌（Pantoea agglomerans）對稻谷的致病性[J]. 福建農(nóng)林大學學報（自然科學版），2002（1）：32-36.

HONG Y C， HU F P， HUANG X N. Pathogenicity of Pantoea agglomerans on rice seeds[J]. Journal of Fujian Agriculture and Forestry University （Natural Science edition）， 2002（1）： 32-36.

[24]嚴婉榮，肖敏，肖彤斌，等. 海南火龍果細菌性腐爛病的病原鑒定及田間藥劑篩選[J]. 基因組學與應(yīng)用生物學，2020，39（3）：1185-1190.

YAN W R， XIAO M， XIAO T B， et al. Pathogen identification and screening of field agents on dragon fruit bacterial rot disease in Hainan[J]. Genomics and Applied Biology， 2020， 39（3）： 1185-1190.

[25]郭安柱，張力元，李巖，等. 防治核桃黑斑病藥劑篩選及田間藥效試驗[J]. 西北林學院學報，2020，35（1）：177-182.

GUO A Z， ZHANG L Y， LI Y， et al. Selection and field application of effective bactericides against walnut blight[J]. Journal of Northwest Forestry University， 2020， 35（1）： 177-182.