岑興 廖楚航 費(fèi)偉 周昊

實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境通常是乏氧環(huán)境，這有利于細(xì)胞因子的釋放促進(jìn)血管生成從而導(dǎo)致腫瘤的進(jìn)程加快[1]。乏氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)是乏氧環(huán)境中重要的信號(hào)傳導(dǎo)分子,它可以調(diào)控基因的表達(dá)產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)促進(jìn)腫瘤發(fā)展，包括血管生成、細(xì)胞增殖、凋亡、糖酵解和pH調(diào)節(jié)[2]。之前的研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中發(fā)現(xiàn)HIF-1α的異常表達(dá)，包括口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)[3-4]。

在本研究中，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)、Western blot檢測(cè)了OSCC臨床標(biāo)本中HIF-1α的mRNA和蛋白表達(dá)情況，使用RNA干擾(RNA interference,RNAi)下調(diào)HIF-1α在OSCC動(dòng)物模型中的表達(dá)，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，檢測(cè)HIF-1α和VEGF的表達(dá)水平，同時(shí)檢測(cè)了腫瘤細(xì)胞的凋亡情況和微血管密度(microvascular density,MVD)。初步探尋HIF-1α在OSCC發(fā)生和發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 腫瘤標(biāo)本的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本來(lái)自四川省人民醫(yī)院頜面外科2019 年01 月～2019 年06 月手術(shù)切除的新鮮腫瘤組織(12 例)，年齡60～82 歲，所有患者病理證實(shí)均為OSCC；對(duì)照組為術(shù)中冰凍病理結(jié)果證實(shí)無(wú)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)的正常組織。所有患者均簽署知情同意書,本研究獲得四川省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 RT-PCR 檢測(cè)

取保存的腫瘤組織樣本12 例，分別磨碎后加入Trizol(50 mg 組織加入1 ml)抽提RNA，并用RevertAidTM試劑盒(Thermo，USA)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(ABI Prism 7700，USA)。

1.3 Western blot檢測(cè)

使用蛋白提取試劑盒(北京索萊寶)提取腫瘤組織蛋白，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(Pierce，USA)測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性后，冷卻上樣，凝膠電泳半干法轉(zhuǎn)入PVDF膜后置于封閉緩沖液(搖床振蕩1 h)，分別加入目標(biāo)基因一抗(1∶10 000，cell signaling technology，USA) ，4 ℃過(guò)夜，TBS/T洗滌后孵育二抗，ECL顯影條帶并進(jìn)行灰度分析(Bio-Rad，USA) 。

1.4 IHC檢測(cè)

免疫組化染色過(guò)程按試劑盒所附說(shuō)明進(jìn)行，石蠟標(biāo)本4 μm連續(xù)切片, 常規(guī)脫蠟;抗原修復(fù); 加入HIF-1α抗體(北京中杉金橋)后，孵育1 h;加入二抗，孵育20 min;加入DAB溶液顯色，蒸餾水沖洗、復(fù)染、脫水、透明封片，電子顯微鏡下觀察采圖。

1.5 HIF-1α特異siRNA慢病毒載體的構(gòu)建

表達(dá)HIF-1α特異siRNA慢病毒載體由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成包裝。

1.6 腫瘤模型建立以及RNAi體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株 Tca8113 購(gòu)自四川大學(xué)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 基本實(shí)驗(yàn)步驟如下; 細(xì)胞株從液氮冰存中復(fù)蘇，培養(yǎng)于RPMI 培養(yǎng)液(15%滅活小牛血清，青霉素200 U/ml，鏈霉素200 U/ml)，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制備濃度為 1 ×107/ml 細(xì)胞懸液，皮下接種于30 只裸鼠背部，每個(gè)部位接種約0.1 ml。待腫瘤體積達(dá)到100 mm3，分別瘤內(nèi)注射相同體積(0.1 ml)的生理鹽水(Mock組)，表達(dá)非特異性siRNA的質(zhì)粒(pUc組)和表達(dá)HIF-1α特異siRNA的質(zhì)粒(pU組)，每組10 只。每5天注射1 次，共注射4 次。從第5天開始，每5天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤體積，利用公式腫瘤體積=長(zhǎng)徑×(短徑)2×1/2計(jì)算。最后1 次測(cè)量腫瘤體積后采用頸椎脫位法處死裸鼠，完整分離組織；一半組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋；另一半立即存放于液氮罐中，后轉(zhuǎn)存于-70 ℃冰箱，備后續(xù)檢測(cè)。

1.7 HIF-1α表達(dá)檢測(cè)

利用RT-PCR、Western blot和IHC檢測(cè)裸鼠瘤體內(nèi)HIF-1α的表達(dá)變化，方法同1.2-1.4。

1.8 腫瘤細(xì)胞凋亡的測(cè)定

按照TUNEL試劑(碧云天，上海元業(yè)興生物科技有限公司)盒說(shuō)明，對(duì)腫瘤組織中凋亡細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定。

1.9 VEGF的檢測(cè)和微血管計(jì)數(shù)

利用Western blot檢測(cè)VEGF的表達(dá)變化情況。CD34染色后，選擇2 個(gè)血管化程度較高的區(qū)域進(jìn)行微血管計(jì)數(shù)，采用低光度數(shù)(×10物鏡)進(jìn)行計(jì)數(shù)。最終的MVD值為每個(gè)高血管化區(qū)域(總面積：2.65 mm2)的3 個(gè)評(píng)價(jià)高倍視野(×25物鏡)的平均值。具有清晰管腔或明確線形血管形狀的血管被考慮用于計(jì)數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 腫瘤標(biāo)本中HIF-1α的表達(dá)

結(jié)果顯示在OSCC患者腫瘤標(biāo)本中HIF-1α的mRNA和蛋白的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)(圖 1)。

圖 1 腫瘤組織和正常組織中HIF-1α的mRNA和蛋白的表達(dá)

2.2 HIF-1α抑制效果的檢測(cè)

PCR和Western blot結(jié)果顯示在注射了表達(dá)HIF-1α特異siRNA的移植瘤模型中，HIF-1α的mRNA和蛋白的表達(dá)明顯比對(duì)照組降低(P<0.05)(圖 2A)。

2.3 腫瘤生長(zhǎng)的變化

腫瘤大體圖片示pU組瘤體的組明顯低于大小Mock組和pUc組(圖2 A)；生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示pU組的生長(zhǎng)趨勢(shì)明顯慢于其他組(P<0.05)(圖 2B)。

圖 2 荷瘤裸鼠腫瘤增長(zhǎng)

2.4 HIF-1α的抑制效果

PCR、Western blot和IHC結(jié)果均顯示在pU組中HIF-1α的表達(dá)水平相對(duì)于Mock組和pUc組明顯降低(P<0.05)(圖 3)。

圖 3 3 組樣本中HIF-1α的mRNA、蛋白表達(dá)

2.5 腫瘤組織凋亡的變化

TUNEL結(jié)果顯示在pU組中，凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯要高于其他組(P<0.05)(圖 4)。

圖 4 3組腫瘤組織樣本中細(xì)胞凋亡(TUNEL)

2.6 VEGF表達(dá)和微血管密度變化

Western blot結(jié)果顯示在pU組中VEGF的表達(dá)顯著低于對(duì)照組(圖 5A)；同時(shí)，微血管密度(MVD)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，pU組中的MVD明顯低于對(duì)照組(P<0.05)(圖 5B)。

圖 5 腫瘤組織中VEGF的表達(dá)及MVD

3 討 論

癌癥目前被認(rèn)為是由于基因的突變和異常表達(dá)導(dǎo)致的，這些基因的改變賦予細(xì)胞許多特定功能，如細(xì)胞增殖、生存、侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，基因靶向治療可能成為控制癌癥進(jìn)展的一種有效的方法。

實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)很大程度上依賴于血管生成，腫瘤組織表現(xiàn)出比健康組織更低的氧合水平[1]。缺氧觸發(fā)了血管生成機(jī)制，HIF-1在這個(gè)過(guò)程中起了重要的作用，HIF-1是一種由HIF-1α和HIF-1β亞基組成的異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)腫瘤細(xì)胞暴露在缺氧中時(shí)，它被穩(wěn)定和激活，促進(jìn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因涉及腫瘤生物學(xué)的許多方面，包括血管生成、無(wú)氧能量代謝、細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲和凋亡[5-6]。同時(shí)，多種腫瘤抑制蛋白和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑表達(dá)失調(diào)的結(jié)果也使HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性增加。已在多種人類腫瘤中檢測(cè)到HIF-1α濃度升高，其表達(dá)水平與惡性程度和生存預(yù)后相關(guān)[3-4]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)在OSCC患者的腫瘤組織中HIF-1α的表達(dá)明顯高于正常組織。

以往的研究揭示了HIF-1α參與腫瘤發(fā)展過(guò)程的生物學(xué)機(jī)制：首先，p53或VHL的丟失通過(guò)干擾其泛素化和蛋白酶體降解來(lái)增加HIF-1α蛋白的表達(dá)[7]；隨之，HIF-1α進(jìn)入細(xì)胞核并與存在于促進(jìn)對(duì)缺氧的生理反應(yīng)的各種基因中的HRE結(jié)合，包括上調(diào)VEGF，以及糖酵解酶和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[8]，這些基因的上調(diào)通過(guò)增加腫瘤細(xì)胞中葡萄糖的供應(yīng)和代謝來(lái)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)[9]，而VEGF由于其血管生成特性發(fā)揮了核心作用。Miele等[10]發(fā)現(xiàn)p42/p44MAPK通路在胰島素樣生長(zhǎng)因子-1誘導(dǎo)的HIF-1α活化和VEGF中起重要作用。Lauhner等[11]的研究報(bào)道了HER2信號(hào)通過(guò)HIF-1a誘導(dǎo)VEGF基因的轉(zhuǎn)錄激活，這種激活依賴于PI3K和AKT的活性。在乏氧條件下，髁突軟骨細(xì)胞中HIF-1α和VEGF的表達(dá)成正相關(guān)[12]；另外，在人類導(dǎo)管原位癌和浸潤(rùn)性乳腺癌中HIF-1α過(guò)表達(dá)與HER2、VEGF表達(dá)及MVD顯著相關(guān)[13]，HIF-1α功能喪失可抑制腫瘤血管生成，而HIF-1α功能增強(qiáng)可促進(jìn)腫瘤血管生成[14]。與此相一致，研究結(jié)果表明，在體內(nèi)外RNAi下調(diào)HIF-1α的表達(dá)時(shí)，VEGF的表達(dá)明顯受到抑制，并且在口腔鱗癌移植瘤中也同時(shí)發(fā)生了顯著的MVD抑制。因此，可以推測(cè)針對(duì)HIF-1α的RNAi可能通過(guò)下調(diào)血管生成因子(如VEGF)來(lái)阻止口腔腫瘤血管生成，從而阻止腫瘤的進(jìn)程。

另一方面HIF-1α在癌癥的發(fā)展過(guò)程中還具有促進(jìn)增殖和抗凋亡的作用。HIF-1α被證明在低氧誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞凋亡方面具有保護(hù)作用[15]。Yoshida等[16]發(fā)現(xiàn)HIF-1α可防止垂體腺瘤HP75細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)的凋亡。Mizuno等[17]報(bào)道了RNAi介導(dǎo)的HIF-1α下調(diào)顯著抑制了肝膽和胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。另外，HIF-1α的一些靶基因也參與增殖因子和抗凋亡因子的形成，如VEGF、胰島素樣生長(zhǎng)因子-2、血小板衍生生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β，這些因子與其受體結(jié)合激活信號(hào)傳遞[18]。IAP-2是一種抗凋亡蛋白，也被認(rèn)為是HIF-1α介導(dǎo)的候選因子[19]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，在HIF-1α被抑制之后，腫瘤在體內(nèi)生長(zhǎng)也受到抑制，凋亡細(xì)胞明顯增多，HIF-1α可能在刺激癌細(xì)胞增殖和抑制凋亡方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。

綜上所述，RNAi下調(diào)HIF-1α的表達(dá)抑制了口腔鱗癌進(jìn)展的許多關(guān)鍵步驟。為臨床上采用靶向HIF-1α技術(shù)治療OSCC，特別是防治癌細(xì)胞存活和血管生成方面提供了重要的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。