岳二麗 李夏寧 趙紅宇

流體剪切應(yīng)力(fluid shear stress，F(xiàn)SS)通過細胞表面不同信號通道將力學信號傳導到細胞內(nèi)部，引起細胞發(fā)生一系列適應(yīng)性改變，這是骨骼功能適應(yīng)性的基本細胞學原理[1-2]。至今為止，生物應(yīng)力作用下細胞形態(tài)學改變的研究尚較少，本研究擬采用精密的定常流加載系統(tǒng)對成骨細胞MG-63分別給予強度為7 dynes/cm2和12 dynes/cm2的FSS作用，通過觀察不同時間成骨細胞MG-63形態(tài)學的改變，從細胞動力學角度對種植體周圍骨重建的發(fā)生機理進行探討。

1 材料與方法

1.1 主要設(shè)備和儀器

清潔超凈臺(SW-CJ-IFD，蘇州凈化設(shè)備公司)；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(BB15，Heraeus，德國)；倒置相差顯微鏡(CKX41，Olympus，日本)；臺式低速離心機(BS400，DENLEY)；純水制備系統(tǒng)(Rios 150，Millipore，美國)；定常流加載系統(tǒng)(MASTERFLEX蠕動泵系統(tǒng)，F(xiàn)isher Scientific International Inc公司，美國)。

1.2 主要試劑

胎牛血清(FBS)、雙抗(青霉素100 U/L，鏈霉素100 μg/L)(Gibco公司,美國)；DMEM低糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶&0.02%EDTA(Hyclone公司，美國)；PBS平衡鹽緩沖液(武漢博士德公司)；DMSO(Sigma公司，美國)。

1.3 主要試劑的配制

細胞完全培養(yǎng)液：DMEM培養(yǎng)基加體積分數(shù)為10%的FBS及1%～5%雙抗。

1.4 細胞培養(yǎng)

成骨細胞MG-63(四川大學華西口腔醫(yī)院)培養(yǎng)于完全低糖DMEM培養(yǎng)液[內(nèi)含10%胎牛血清，1%～5%雙抗(青霉素100 U/L，鏈霉素100 μg/L)，pH 7.2]，置于CO2孵箱(37 ℃，5%CO2，95%空氣)，每隔2 d換1 次液。

1.5 細胞爬片制作

取對數(shù)生長期的MG-63細胞進行消化，制成單細胞懸液，細胞計數(shù)并調(diào)整細胞密度，以5×104/mL接種于已處理好的載玻片，加液，孵箱孵育2～4 h，備用。

1.6 成骨細胞性能鑒定

堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)測定采用改良鈣鈷法(Gomori Ca-co法)；骨鈣素(bone glaproyein，BGP)測定采用免疫細胞化學SABC顯色法，操作步驟按試劑盒說明書進行。礦化結(jié)節(jié)染色采用茜素紅染色和鈣染色(Von Kossa染色)2 種方法。

1.7 流體加力條件優(yōu)化

本研究采用定常流加載系統(tǒng)對MG-63細胞施加FSS，該系統(tǒng)包括流室、MASTERFLEX蠕動泵和儲液池等。FSS強度決定于液體流動速度并用公式σ=6μQ/H2W得出，其中μ(mPa.s)為粘滯系數(shù)，Q(mL/min)為單位時間內(nèi)通過流室的液體體積，H為流室頂壁和置入載玻片表面的垂直距離。W為流室的寬度。DMEM培養(yǎng)基為細胞加載所用液體，粘滯系數(shù)經(jīng)測定為0.86×10-2dynes.s/cm2。

1.8 細胞加力、染色和拍照

采用密閉流室加力系統(tǒng)，通過蠕動泵產(chǎn)生FSS。將細胞融合(約80%)鋪滿載玻片的細胞爬片置入密閉無菌流室的平行池槽，固定，對MG-63細胞進行7 dynes/cm2和12 dynes/cm2加力。作用時間分別為15、30、60和120 min。將細胞分為9 組，其中1組為對照組(同等條件培養(yǎng)但未加力)；余下8組分別施以不同強度不同時間的FSS作為實驗組，加力過程中保持應(yīng)力大小穩(wěn)定，加力結(jié)束后即刻收獲細胞。蘇木素(精)-伊紅染色，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并照相。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 成骨細胞性能檢測

MG-63細胞ALP染色、BGP免疫組化染色及礦化能力檢測均呈陽性(圖 1)。

圖 1 MG-63成骨細胞性能檢測

2.2 對照組MG-63的細胞形態(tài)

無剪切力作用的對照組MG-63細胞有梭形、三角形、球形和紡錘形等不規(guī)則的形態(tài)，偶見巨細胞、多核細胞及多極分裂相細胞，核質(zhì)比較大，細胞核形狀不規(guī)則，核仁多，多為3～5 個，染色質(zhì)呈顆粒狀，細胞質(zhì)著色深且體積小，突起有多種形狀，如鋸齒狀或片狀(圖 2)。

圖 2 對照組MG-63成骨細胞(HE, ×400)

2.3 強度為7 dynes/cm2的FSS作用不同時間時的細胞形態(tài)比較(HE染色)

在生理負荷應(yīng)力范圍內(nèi)，隨著強度為7 dynes/cm2的FSS作用時間的增加(15、30和60 min)，細胞極性增強，細胞形態(tài)逐漸呈紡錘樣改變，細胞排列由原來雜亂不規(guī)則逐漸變規(guī)則，尤其是細胞長軸與剪切應(yīng)力方向一致的細胞胞體被拉伸；胞核偏移，胞核分裂現(xiàn)象增加或核質(zhì)比增大，表現(xiàn)出細胞增殖能力增強。當細胞加力時間為120 min時，細胞開始出現(xiàn)較多的細胞胞突，細胞形態(tài)不規(guī)則，核分裂相增多或核質(zhì)比例變大，偶出現(xiàn)核邊集，凋亡等現(xiàn)象，胞漿內(nèi)偶見空泡(圖 3)。

圖 3 7 dynes/cm2的FSS作用MG-63細胞不同時間時的細胞形態(tài)比較 (HE，×200)

用Image-pro plus圖像分析軟件對細胞照片進行處理，由圖 4可以看出隨著受力時間的延長，強度為7 dynes/cm2的FSS作用下細胞的形態(tài)變化不規(guī)則，但細胞面積均有增大的趨勢，并且與對照組(細胞平均面積為25 865.90±3 782.21)相比，應(yīng)力作用30、60和120 min時(細胞平均面積為40 187.55±1 674.31、40 892.39±1 792.75和44 564.74±3 875.77)MG-63細胞面積均增加(P<0.05)，此時的應(yīng)力刺激信號可誘導細胞形態(tài)變化。組間比較結(jié)果表明，應(yīng)力作用0、15 min(細胞平均面積為27 974.90±2 758.49)時細胞面積變化無明顯差異(P>0.05)，且應(yīng)力作用30、60與120 min時3 組之間細胞面積變化差異亦無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖 4 7 dynes/cm2的流體剪切應(yīng)力作用下細胞面積比較

2.4 強度為12 dynes/cm2的FSS作用不同時間時的細胞形態(tài)比較(HE染色)

如圖 5，在強度為12 dynes/cm2的FSS作用下，隨著加力時間(0、15、30和60 min)增加，細胞極性改變，細胞形態(tài)由不規(guī)則逐漸向紡錘狀改變，細胞長軸改變明顯，細胞排列由原來雜亂無序逐漸變?yōu)橐?guī)則排列。

圖 5 強度為12 dynes/cm2的FSS作用不同時間時的細胞形態(tài)比較(HE，×200)

其中，強度為12 dynes/cm2的FSS作用15 min和30 min時可觀察到細胞極性增強，細胞長軸與FSS方向一致的細胞胞體被拉伸，且有部分細胞胞突擺動的方向與應(yīng)力方向趨于一致。當應(yīng)力作用60 min時細胞骨架改變較明顯，細胞胞突增加，細胞形態(tài)規(guī)則性稍差，但細胞排列與應(yīng)力方向的一致性較為明顯，細胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的胞核偏移，且受力細胞中核質(zhì)比例增加明顯，約(1∶1～1.5∶1)胞核分裂相增加，表現(xiàn)出細胞增殖能力增強。當應(yīng)力作用120 min時，細胞形態(tài)變化更為明顯，胞突增加，胞體膨脹或皺縮，可見較多細胞核出現(xiàn)核碎裂，核邊集，甚至出現(xiàn)細胞凋亡，細胞脫落現(xiàn)象。

用Image-pro plus圖像分析軟件對細胞照片進行處理，由圖 6可見，在強度為12 dynes/cm2的FSS作用下，隨著受力時間的延長，細胞的形態(tài)變化不規(guī)則，但直徑和面積均有增大的趨勢，并且與對照組(加力0 min)(細胞平均面積為25 865.90±3 782.21)相比，應(yīng)力作用60 min和120 min時(細胞平均面積為42 248.61±1 425.53、49 025.22±2 174.47)細胞面積均增加(P<0.05)。組間比較結(jié)果表明：應(yīng)力作用0、15、30 min時(細胞平均面積為31 916.79±8 053.22和28 657.32±1 145.16)細胞面積之間無明顯差異(P>0.05)；應(yīng)力作用60 min和120 min時細胞面積之間差異亦無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖 6 12 dynes/cm2的流體剪切應(yīng)力作用下細胞面積比較

2.5 強度為7 dynes/cm2和12 dynes/cm2的FSS分別作用不同時間時細胞平均面積比較

從圖 7可以看出，強度為7 dynes/cm2和12 dynes/cm2的FSS分別作用不同時間(15、30、60和120 min)時細胞面積平均值均有增加。用Image-pro plus圖像分析軟件檢測結(jié)果顯示：在相同作用時間段內(nèi)，除在作用30min時兩種流速的FSS下細胞平均面積差異具有統(tǒng)計意義外(P<0.05)，其他時間兩種作用力下的細胞平均面積差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖 7 不同F(xiàn)SS作用下MG-63細胞面積的比較

3 討 論

機械刺激誘導成骨細胞的正性調(diào)節(jié)對于骨的生成和修復具有至關(guān)重要的作用，而FSS是作用于骨組織的一種常見機械刺激。研究表明，F(xiàn)SS在細胞增殖、分化、基因表達和凋亡等過程中起著重要的作用[3-5]。在機械刺激的作用下，細胞整合素、第二信使系統(tǒng)和應(yīng)力反應(yīng)元件等做出響應(yīng)，細胞骨架的構(gòu)件通過重排分散了張力和壓力，最終導致細胞發(fā)生形變[6-8]。

表 1 7 dynes/cm2和12 dynes/cm2的流體剪切應(yīng)力對MG-63細胞平均面積影響的比較

至今為止，機械應(yīng)力作用下細胞形態(tài)學改變的研究尚較少。本研究所使用的定常流加載系統(tǒng)，是通過精密蠕動泵提供恒定的流體速度，以保證對成骨細胞施以可控的剪切應(yīng)力。本次研究中分別對成骨細胞MG-63施以不同強度的FSS，運用HE染色相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)：FSS可以促進成骨細胞形態(tài)發(fā)生改變，這些改變包括：細胞呈紡錘樣改變，細胞形態(tài)拉長，細胞表面胞突增多等，約有一半的細胞出現(xiàn)與應(yīng)力方向一致的方向性改變。

MG-63起源于成骨細胞的前體或分化為成骨細胞的骨髓間充質(zhì)干細胞，它是具有成骨細胞表性特征的一類特殊腫瘤細胞群體，其分化過程類似于成骨細胞[9-10]。研究證實MG-63是一種具有成骨細胞表性特征的標準成骨細胞，其生長過程與正常人成骨細胞一樣可分為細胞增殖、骨基質(zhì)成熟和骨基質(zhì)礦化階段。本研究中選用成骨細胞MG-63作為研究對象，并通過預試驗又一次對其成骨細胞特性做了印證，檢測發(fā)現(xiàn)MG-63細胞形態(tài)與成骨細胞相似，具有不規(guī)則外形、堿性磷酸酶活性和骨鈣素表達陽性的特點，而且體外培養(yǎng)MG-63約3～4 周時可觀察到礦化結(jié)節(jié)形成。

近年來已有許多學者對機械應(yīng)力作用下的成骨細胞增殖數(shù)目及相關(guān)基因蛋白表達的變化進行了研究并取得了一定的成果，但應(yīng)力的大小和作用時間對細胞的生物學行為及細胞形態(tài)學變化的影響等尚不明確[11-13]。通過反復調(diào)試觀察并結(jié)合相關(guān)文獻，本實驗選擇兩種強度(7 dynes/cm2和12 dynes/cm2)的FSS作用，以4 個時間段(15、30、60和120 min)分組，觀察不同強度的FSS在不同作用時間下成骨細胞的形態(tài)及面積改變。該實驗發(fā)現(xiàn)成骨細胞對不同強度的FSS信號的敏感性不同，并且同一FSS作用時間不同成骨細胞的形態(tài)的改變亦不同。與強度為7 dynes/cm2的FSS相比，強度為12 dynes/cm2的FSS對成骨細胞形態(tài)具有明顯的影響；并且加力時間不超過60 min時，強度為12 dynes/cm2的FSS對細胞的促進增殖和分化作用更為明顯，其中，強度為12 dynes/cm2的FSS對成骨細胞作用60 min時，應(yīng)力對細胞形態(tài)影響較大，細胞核分裂增殖最為明顯。FSS作用下成骨細胞形態(tài)發(fā)生了適應(yīng)性變化[14-16]，可能改變成骨細胞的細胞骨架、微管及微絲重新排列、微管極性改變等，目的在于促進應(yīng)力部位的骨形成，相對較少骨吸收。而細胞排列改變是因為細胞長軸與剪切應(yīng)力方向一致能使細胞受到的應(yīng)力降低，減少對流體的阻力，有利于細胞更好地維護自身的生理功能，此能力可能與成骨的方向有關(guān)。

該實驗結(jié)果為進一步探索FSS大小、作用時間與細胞增殖、分化和凋亡的量效及時效關(guān)系提供了依據(jù)，并且從細胞形態(tài)學方面為探討FSS作用下力學信號在種植體細胞界面的轉(zhuǎn)導機制提出了新思路。