王曉娟 郭姚淼 張凱歌 楊路明 楊森 朱華玉

摘? ? 要：黃綠葉色突變體是研究葉綠體發(fā)育和光合能力的重要材料，前期精細定位到一個控制葉色的CmGLK基因。為了更好地研究其功能，以黑皮甜瓜自交系HB42為輪回親本，黃綠葉色突變體M68為供體親本;利用與黃綠葉色共分離的cmglk-dCAPS1標記為前景選擇標記，及163對在親本間多態(tài)性好、染色體上分布相對均勻的SSR標記為背景選擇標記，構(gòu)建了HB42遺傳背景下的cmglk近等基因系，并對其表型進行分析。結(jié)果顯示，在回交兩代后的入選群體平均背景回復(fù)率超過非選擇條件下的理論值，BC1F1和BC2F1世代最高背景回復(fù)率單株分別為81.63%、93.98%。背景回復(fù)率最高的3個BC2F2代cmglk純系植株的表型顯示其葉色表型均為黃綠色，成熟期果實大小和含糖量與野生型相比也顯著下降。

關(guān)鍵詞：甜瓜;黃綠葉色;分子標記;近等基因系

中圖分類號：S652 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）06-011-09

Molecular marker-assisted construction of CmGLK near-isogenic lines in melon

WANG Xiaojuan， GUO Yaomiao， ZHANG Kaige， YANG Luming， YANG Sen， ZHU Huayu

（College of Horticulture， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： The yellow-green leaf mutants are important materials for the study of chloroplast development and photosynthetic capacity. We have fine mapped a CmGLK gene controlling the leaf color in melon. To better investigate the biological function of the CmGLK gene in melon， we constructed a near-isogenic line of the cmglk gene by molecular marker-assisted selection. In our current study， a black rind melon inbred line HB42 was used as the recurrent parent， and the yellow-green leaf mutant M68 as the donor parent which resulted from the mutation of CmGLK gene. In the marker assisted selection， the cmglk locus co-segregating marker dCAPS1 was used as foreground selection marker， and 163 SSR markers with good polymorphism and relatively distributed on 12 chromosomes of melon were selected as background selection markers to develop the near-isogenic line of cmglk gene in the HB42 background. The results showed that the average background recovery rate of the selected population was significantly higher than the theoretical value under non-selective conditions after two generations of backcrossing. Furthermore， we investigated the phenotypes of three homozygous cmglk plants with the highest recovery rate in BC2F2 generation， which showed that all of them had yellow-green leaf color phenotype and their fruit sizes and sugar content at maturity were also significantly reduced compared to the wild type HB42.

Key words： Melon; Yellow-green leaf; Molecular markers; Near-isogenic lines

甜瓜（Cucumis melo L.）為葫蘆科（Cucurbitaceae）甜瓜屬（Cucumis）一年生蔓生植物，含有豐富的碳水化合物以及檸檬酸等人體所需的營養(yǎng)物質(zhì)，深受人們的喜愛[1]。目前甜瓜已在世界范圍內(nèi)廣泛栽培，并且成為中國、伊朗、土耳其等世界甜瓜生產(chǎn)大國出口創(chuàng)匯的重要農(nóng)作物之一[2]。我國是最早栽培甜瓜的國家之一，同時也是世界上甜瓜栽培面積最大、產(chǎn)量最高的國家[3]。作為栽培甜瓜重要的起源地之一，我國甜瓜種質(zhì)資源十分豐富[4]。

近等基因系（Near-isogenic line， NIL）是指除了決定目標性狀的基因不同，其他遺傳背景完全相同的一組遺傳材料（品系）[5]。最早由Young等[6]和Muclmore等[7]提出，它在作物的品種改良[5-8]、基因定位[9-10]、基因的功能分析和遺傳互作[11-12]等方面具有重要作用。通過構(gòu)建近等基因系，還可以觀察同一基因在不同遺傳背景下的表現(xiàn)，從而可以判斷其在育種上的利用價值[13]。

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)瓜類分子育種課題組保存的一個甜瓜黃綠葉色材料M68，與正常甜瓜材料相比，其植株在整個生長周期中均表現(xiàn)為黃綠色表型，葉片中葉綠素含量顯著降低，而且光合速率也明顯下降，遺傳分析及基因定位表明，該性狀由位于第11條染色體上一對隱性單基因（yellow green leaf，ygl）控制，該基因編碼一個GLK轉(zhuǎn)錄因子。在M68中該基因發(fā)生了一個堿基缺失導(dǎo)致移碼突變，從而導(dǎo)致其功能喪失。進一步利用該位點開發(fā)了一個dCAPS1標記，對甜瓜自然群體材料進行基因型分析，表明該標記與黃綠葉色表型共分離[1， 14]。

為了進一步研究甜瓜黃綠葉色基因的功能及其作用機制，筆者利用分子標記輔助選擇技術(shù)，通過雜交、回交及自交等手段，結(jié)合前景選擇和背景選擇快速高效構(gòu)建了cmglk基因在黑皮甜瓜自交系HB42遺傳背景下的近等基因系，研究該基因在不同遺傳背景下的表現(xiàn)，同時也為后續(xù)深入研究CmGLK基因的功能及其調(diào)控機制提供了很好的研究材料。

1 材料與方法

1.1 材料

選用黑皮甜瓜自交系HB42為輪回親本，黃綠葉色材料M68為cmglk的供體親本，兩個親本均來自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)瓜類作物育種課題組。由HB42×M68雜交獲得F1代群體，將F1與輪回親本連續(xù)回交2次，獲得BC1F1（F1×HB42）、BC2F1（BC1F1×HB42）2個回交群體，由BC2F1群體入選單株自交獲得BC2F2群體。

1.2 田間管理

材料于2018年至2020年種植于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)（鄭州毛莊）。2018年春季在塑料大棚中對HB42、M68進行播種、育苗管理，并配制雜交世代F1。2018年秋季對HB42、M68及其F1進行播種育苗管理，并以HB42為輪回親本與F1回交配制BC1F1。2019年春季對HB42、M68及其BC1F1進行播種育苗管理，并以HB42為輪回親本與BC1F1回交配制BC2F1。2019年秋季HB42、M68及其BC2F1進行播種育苗管理，將BC2F1自交獲得BC2F2。2020年夏季對HB42、M68及其BC2F2進行播種育苗管理，并自交獲得純系。每株材料均以單瓜收種。在對野生型HB42、突變體M68及其近等基因系進行表型觀察試驗中，采用完全隨機試驗設(shè)計，單株小區(qū)，5次重復(fù)，正常田間管理。

1.3 引物設(shè)計

筆者在本研究中根據(jù)前期黃綠葉色基因CmGLK的精細定位結(jié)果，使用與其共分離的cmglk-dCAPS1[14]作為前景選擇標記。背景選擇標記為從Zhu等[15]公布的甜瓜全基因組SSR標記中篩選出來的、均勻分布于甜瓜12條染色體上的163對引物，如附表1所示，并使用MapChart 2.2軟件繪制SSR標記在染色體上的分布圖。

1.4 甜瓜基因組DNA提取

在甜瓜幼苗2葉1心期采集幼嫩葉片，采用CTAB改良法[1]提取并檢測樣品DNA，用無菌1×TE稀釋至所需濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR擴增、電泳與銀染檢測

參照孫小粉[16]的PCR擴增體系、反應(yīng)程序，以及聚丙烯酰胺凝膠制備與銀染顯色的詳細操作流程進行背景選擇SSR標記篩選分析。前景選擇分析使用cmglk-dCAPS1標記以10 μL體系進行PCR擴增，體系和程序與SSR標記相同，cmglk-dCAPS1酶切體系參考程思源[13]的方法，使用Bcc I酶進行37 ℃恒溫酶切80 min，然后65 ℃ 20 min終止反應(yīng)。

1.6 近等基因系構(gòu)建方法

如圖1所示，由HB42×M68雜交獲得F1代，將F1與HB42回交獲得BC1F1，利用cmglk-dCAPS1標記對BC1F1單株進行前景選擇，首先選出攜帶GLK/glk雜合位點的單株，再利用背景選擇標記對這些單株進行背景選擇，選出背景回復(fù)率最高的單株，進一步與HB42回交獲得BC2F1，用同樣的方法選出BC2F1群體中含有GLK/glk雜合位點且背景回復(fù)率最高的單株，將該單株自交獲得BC2F2群體，對BC2F2群體中具有黃綠葉色的單株進行背景選擇，獲得背景回復(fù)率最高的單株即完成了近等基因系的構(gòu)建。

根據(jù)Hospital等[17]的輪回親本背景回復(fù)率（Proportion of Recurrent Parent Genome，PRPG）計算公式進行計算：

[PRPG（g）=L+X（g）2L]×100%;? ? ? ? ? ? ?（1）

[G（g）=1-12g+1]。? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?（2）

公式（1）為BCg世代的輪回親本背景回復(fù)率，X（g）代表BCg世代中背景選擇標記帶型與輪回親本一致的標記數(shù)量，L代表全部背景選擇標記;公式（2）為BCg世代的理論背景回復(fù)率。假定各標記位點間相互獨立，g為回交次數(shù)。

1.7 表型性狀調(diào)查

在甜瓜幼苗3葉1心時期，對野生型HB42、突變體M68及其近等基因系進行表型觀察;授粉后35 d，測量各株系的果實質(zhì)量、長度、寬度和果瓤可溶性固形物含量。每個株系隨機選取3個單株分別進行3次測量。果實質(zhì)量使用電子天平（TD31001）稱量，單位以g計。果實尺寸使用直尺進行測量，單位以cm計。果實可溶性固形物含量使用PAL-1手持折光儀（ATAGO，日本）進行測量，單位以%計。

1.8 數(shù)據(jù)整理與分析

酶切產(chǎn)物帶型有3種，與輪回親本HB42帶型一致標為1，與供體親本M68帶型一致標為2，雜合帶型標為3，缺失帶型標為0。背景選擇標記與此類似，數(shù)據(jù)均在Excel 2016中處理，套入上述公式計算每個單株的背景回復(fù)率。將輸入至Excel的背景選擇條帶位點數(shù)據(jù)整理成GGT 2.0軟件數(shù)據(jù)格式，打開軟件導(dǎo)入數(shù)據(jù)繪制入選單株的圖示基因型和染色體圖譜。其中紫色代表遺傳背景回復(fù)率的區(qū)域，黃色代表雜合區(qū)域，紅色為缺失標記。果實農(nóng)藝指標所有數(shù)據(jù)在Excel 2016中整理與分析。使用SPASS 17.0軟件進行卡平方、顯著性測驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本間背景選擇SSR標記的篩選

利用野生型HB42和突變體M68 兩個親本基因組DNA，對甜瓜12條染色體上均勻分布的380對SSR標記進行多態(tài)性檢測，共篩選出163對在親本間具有多態(tài)性、且差異明顯的標記，多態(tài)率為42.89%，用于背景回復(fù)率檢測。

163對背景選擇標記見表1，平均每條染色體上的標記數(shù)為13.58個。多態(tài)性SSR標記在染色體上的分布數(shù)量相對均勻，多數(shù)染色體上在10～15個SSR標記之間。其中第9染色體上標記數(shù)較少，僅有7對標記;CmGLK基因所在的第11染色體上多態(tài)性標記最多。2個標記之間的平均間距為2.5 Mb，最小間距0.1 Mb，位于第11染色體CmSSR24671、CmSSR24677之間，最大間距為14.77 Mb，位于第7染色體CmSSR17502、CmSSR18236之間。這些背景選擇標記在甜瓜染色體上的具體位置如圖2所示。

2.2 BC1F1群體候選單株的篩選

利用cmglk-dCAPS1標記對100株BC1F1單株進行前景選擇，篩選出46株基因型為GLK/glk雜合位點的單株，符合1∶1分離比，部分dCAPS1酶切結(jié)果如圖3-A所示。用上述163對背景選擇標記對46個BC1F1群體單株進行背景回復(fù)率分析，其中標記CmSSR06968在各單株中的電泳結(jié)果如圖3-B所示。46個單株的背景回復(fù)率平均值為73.27%，最低的單株僅62.05%，最高的單株可達81.63%;有18個單株的回復(fù)率達到非選擇條件下的理論背景回復(fù)率75%，其中有5株的背景回復(fù)率超過了80%，每個單株的遺傳背景回復(fù)基因型如圖4所示。選擇與輪回親本遺傳背景回復(fù)率最高的單株作為候選單株（其背景回復(fù)基因型在染色體上的分布如圖5所示），進行第二次回交產(chǎn)生BC2F1群體。

2.3 BC2F1群體候選單株的篩選

利用cmglk-dCAPS1標記對100株BC2F1群體進行前景選擇分析（圖6-A），選擇出46個目的基因型為雜合位點的單株，遺傳符合1∶1分離比。用163對SSR標記對入選的46個單株進行PCR擴增并分析其輪回親本遺傳背景回復(fù)率（圖6-B）。46個BC2F1候選單株平均背景回復(fù)率為88.92%，最低單株背景回復(fù)率為84.64%，單株最高回復(fù)率為93.98%，33個單株的背景回復(fù)率均在理論值87.5%之上，其中有13株回復(fù)率在90%之上，每個單株的遺傳背景回復(fù)基因型如圖7所示。其中背景回復(fù)率最高的單株各染色體上的基因型分布如圖8所示，大多數(shù)染色體上的背景選擇標記均回復(fù)為輪回親本的遺傳背景，達到了構(gòu)建近等基因系所需輪回親本遺傳背景回復(fù)率的要求。從BC2F1中選擇出與輪回親本遺傳背景最高的3個單株作為候選單株，進行自交產(chǎn)生BC2F2群體。

2.4 cmglk近等基因系的獲得

對BC2F1篩選出的3個株系進行自交后，各選取35株BC2F2進行育苗培養(yǎng)，植株表型發(fā)生分離，在幼苗期即可通過黃綠表型進行前景選擇。3個BC2F2株系分別獲得11、11、9株黃綠色表型單株，經(jīng)卡方測驗，符合孟德爾分離比3∶1。每個BC2F2株系各隨機選取3個單株進行自交繁殖得到純系。

2.5 cmglk近等基因系表型分析

分別對2個親本和3個cmglk近等基因系表型性狀進行觀察。與野生型HB42相比，其近等基因系生長較為緩慢，由圖9-A所示，在野生型HB42的3葉1心時期，其近等基因系第3片真葉還未完全展開，且同一節(jié)位的成熟葉片面積（第2真葉）較野生型小。與野生型HB42相比，突變體M68和近等基因系在真葉抽出后整個營養(yǎng)生長時期在田間都表現(xiàn)出較野生型生長緩慢的趨勢，花期并未表出明顯差異。在授粉后的生殖生長時期，與野生型穩(wěn)定的墨綠色果皮相比，近等基因系的果皮顏色由綠色逐漸表現(xiàn)為深綠色。在授粉后35 d果實成熟期，由圖9-B所示，野生型果皮顏色仍然深于近等基因系果皮顏色，但是內(nèi)部果肉顏色并未顯現(xiàn)出明顯差異。進一步調(diào)查了各株系的果實性狀，由圖9-C所示，發(fā)現(xiàn)近等基因系果實質(zhì)量、長度、果肉厚度以及瓜瓤糖度與野生型果實的各個性狀指標均有顯著差異。上述結(jié)果表明，在遺傳背景相似的情況下，cmglk的突變能夠?qū)е氯~色發(fā)生變化和果實品質(zhì)下降。

3 討論與結(jié)論

葉色突變體是研究植物葉綠素發(fā)育和光合能力的理想材料，相關(guān)基因變異可能會導(dǎo)致植物葉色發(fā)育和果實品質(zhì)性狀受到影響[18-19]。突變體與其野生型之外的正常材料直接進行農(nóng)藝指標差異分析時，往往會因為兩者遺傳背景的差異，產(chǎn)生許多不確定的因素。近等基因系是永久性的群體，它與輪回野生型親本的遺傳背景差異很小，在圖位克隆、精細定位及目的基因的功能分析、農(nóng)藝品質(zhì)分析等方面具有重要作用[20-23]。本試驗構(gòu)建的甜瓜cmglk近等基因系，其目標基因來源于甜瓜黃綠葉色自交系M68，它是一個自然突變材料，該突變體在整個生長周期，全部光合器官的表型均顯現(xiàn)出黃綠顏色，是研究甜瓜葉綠體發(fā)育的理想材料，但其野生型在繁殖過程中已經(jīng)丟失，無法直接進行研究，需要構(gòu)建近等基因系。在本研究中選擇薄皮甜瓜自交系HB42作為輪回親本，其果皮顏色黑色，含糖量較高，與M68的遺傳背景差異大，有助于我們研究不同遺傳背景下CmGLK基因突變后對植株葉色及果實營養(yǎng)品質(zhì)的影響，同時為進一步深入研究CmGLK基因的功能及調(diào)控的分子機制提供很好的研究材料。

傳統(tǒng)的育種技術(shù)是僅依靠田間表型選擇，需要大群體進行多代回交才能選育出高質(zhì)量的近等基因系，耗費大量人工及時間。應(yīng)用分子標記輔助選擇，可大大縮減育種年限、提高構(gòu)建近等基因系的進程和準確度。前人研究表明，通過分子標記輔助選擇回交3次后即可達到遺傳回復(fù)率較高的近等基因系[8]。筆者在本試驗中同時利用前景選擇和背景選擇，通過2次回交，在每一世代都進行基因型回復(fù)率檢測，BC1F1世代背景回復(fù)率平均值略低于非選擇條件下連續(xù)回交的理論背景回復(fù)率，到BC2F1世代已經(jīng)顯著超過非選擇條件下連續(xù)回交的理論背景回復(fù)率，并獲得背景回復(fù)率超過94.0%的單株，遠高于理論背景回復(fù)率87.5%。表明同時利用前景選擇和背景選擇，可以有效提升輪回親本背景遺傳回復(fù)率，快速篩選出攜有輪回親本高遺傳背景的目標基因近等基因系。

Sasaki等[23]將攜帶小穗基因qTSN12.2的IR 64-NIL12材料與其野生型水稻IR 64進行表型比較，發(fā)現(xiàn)近等基因系的穗型更小，莖稈更長，葉片更長且更寬，而且產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀也發(fā)生顯著變化。筆者在本試驗中通過對攜帶黃綠葉色cmglk近等基因系與其野生型材料HB42相比，發(fā)現(xiàn)其葉色表型發(fā)生了顯著變化，且與突變體M68葉色相似;成熟期的果實大小、含糖度等指標也顯著下降。近等基因系材料消除了遺傳背景的影響，能夠證實這些性狀差異是cmglk基因?qū)е碌?。cmglk近等基因系材料的構(gòu)建，不僅證實了cmglk對葉色和果實品質(zhì)的影響，為進一步深入研究CmGLK基因功能及分子機制提供了獨特的材料，而且為分子標記輔助甜瓜育種提供了理論指導(dǎo)，具有重要的理論研究意義和實踐應(yīng)用價值。

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