葉中天，李樂，付書正，劉金平,2，李平亞,2，劉云鶴,2※

（1.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130012；2.吉林大學(xué)天然藥物研究中心，吉林 長春 130021）

肝癌是全球第4大致死性惡性腫瘤，居全球癌癥病死率的第3位，惡性程度高，復(fù)發(fā)率高，易轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重危害著人們的生命健康[1-4]。雖然肝癌的化學(xué)藥物治療已經(jīng)有了很大的進(jìn)展，但仍存在耐藥性強及毒副作用大等問題[5]。美花風(fēng)毛菊[Saussurea pulchella（Fisch.）Fisch]為菊科風(fēng)毛菊屬多年生草本植物[6]，廣泛分布于中國、韓國和俄羅斯。近年研究表明，從美花風(fēng)毛菊中分離得到的化合物具有顯著的抗腫瘤活性[7]。作為一種天然植物，美花風(fēng)毛菊具有多途徑、多環(huán)節(jié)和多靶點的優(yōu)勢[8,9]。民間常用于治療肝炎、關(guān)節(jié)炎和高血壓等疾病[10,11]，但未見有關(guān)美花風(fēng)毛菊抗肝癌活性的研究報道。本文以人肝癌HepG2細(xì)胞株和H22肝癌荷瘤小鼠為研究對象，評價美花風(fēng)毛菊乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位（ESP）的體外和體內(nèi)抗肝癌活性，為美花風(fēng)毛菊的進(jìn)一步開發(fā)與利用提供理論依據(jù)與參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人肝癌HepG2細(xì)胞株和H22肝癌細(xì)胞均購自中國科學(xué)院（上海）典型培養(yǎng)保存委員會細(xì)胞庫。

1.1.2 動物 SPF級昆明小鼠，雌性和雄性，體重18~22 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號：SCXK（遼）2015-0001。所有實驗操作均按照吉林大學(xué)《實驗動物管理和使用指南》進(jìn)行。

1.1.3 材料與試劑 美花風(fēng)毛菊的干燥全草（風(fēng)干）在2018年9月中旬采摘于吉林省磐石市煙筒山鎮(zhèn)石棚村，經(jīng)吉林大學(xué)藥學(xué)院李平亞教授鑒定為[Saussurea pulchella（Fisch.）Fisch]，樣品標(biāo)本保存于吉林大學(xué)天然藥物研究中心；環(huán)磷酰胺（CTX）購自Sigma公司；胎牛血清（FBS）、DMEM高糖培養(yǎng)基購自GIBCO公司；青霉素和鏈霉素購自Solarbio公司；DMSO購自鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；白細(xì)胞介素-2（IL-2）、腫瘤壞死因子-（TNF-）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、血尿素氮（BUN）和肌酐（CRE）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 ESP的制備 取干燥美花風(fēng)毛菊全草1.0 kg，粉碎，加10倍量70%乙醇，加熱回流提取3次，每次3 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮至無醇味，再用3倍體積的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，減壓回收，蒸干，得到美花風(fēng)毛菊乙醇提物的乙酸乙酯萃取部位。

1.2.2 HepG2細(xì)胞的培養(yǎng) 使用DMEM高糖培養(yǎng)基，添加10%FBS、100 mg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗[12，13]。

1.2.3 對HepG2細(xì)胞增殖的影響測定 采用CCK-8法檢測ESP對HepG2細(xì)胞增殖的影響。將HepG2細(xì)胞以5 103個/孔的密度接種于96孔板中，放置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。以二甲基亞砜（DMSO）為溶劑，配制濃度為0g/uL、20g/uL、40g/uL、60g/uL、80g/uL、100g/uL的ESP處理細(xì)胞，將96孔板放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入含10%CCK-8繼續(xù)培養(yǎng)4h，用微板閱讀器在450 nm處測定吸光度值（OD值），并計算細(xì)胞抑制率。其計算公式為：細(xì)胞抑制率（%）=[1-(實驗組OD值-空白組OD值)/（對照組OD值-空白組OD值）]100%。再以細(xì)胞抑制率為縱坐標(biāo)，各給藥劑量為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞增殖抑制曲線，并計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.4 皮下移植瘤模型的建立 在無菌條件下，用生理鹽水將H22肝癌細(xì)胞的濃度調(diào)整為5 106個/mL，并注射入小鼠腹腔。1周后，提取腹水腫瘤細(xì)胞，用生理鹽水稀釋成濃度為1 107個/mL的細(xì)胞懸液。稀釋后的腹水腫瘤細(xì)胞懸液按每只0.2 mL接種到小鼠的右前肢腋窩以建立荷瘤小鼠模型，未接種腫瘤細(xì)胞的小鼠用作正常對照組。

1.2.5 實驗分組及處理 接種后，將小鼠隨機分為6組，每組10只，雌雄各半：正常對照組（生理鹽水）；模型組（生理鹽水）；CTX組（20 mg/kg）；ESP低劑量組（100 mg/kg）；ESP中劑量組（200 mg/kg）；ESP高劑量組（400 mg/kg）。將CTX和ESP分別溶解于生理鹽水中，配制相應(yīng)濃度的水溶液。每組小鼠每天灌胃1次，連續(xù)給藥14 d，給藥劑量均為20 mL/kg。

1.2.6 荷瘤小鼠體重、腫瘤重量、抑瘤率及臟器指數(shù)的測定 每天給藥前，測量小鼠體重。給藥14 d后，頸椎脫臼處死小鼠，并在無菌條件下對腫瘤、肝臟和腎臟進(jìn)行快速分離和稱重。

腫瘤抑制率（tumor inhibition rate,TIR）的計算公式：TIR（%）=（模型組平均瘤重 給藥組平均瘤重）/模型組平均瘤重100%；

臟器指數(shù)計算公式：臟器指數(shù)（mg/g）=平均器官重量/平均體重。

1.2.7 小鼠血清TNF-、IL-2和VEGF含量的測定末次給藥24h后，從眼眶收集血液，在4℃、3 500 r/min的條件下進(jìn)行離心獲得血清，并于﹣20℃儲存。測定方法參照TNF-、IL-2和VEGF酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒使用說明，采用雙抗體夾心法測定小鼠血清樣本中TNF-、IL-2和VEGF含量。

1.2.8 小鼠血清AST、ALT、CRE及BUN的測定測定方法參照AST、ALT、CRE及BUN試劑盒說明書。

1.2.9 組織病理學(xué)檢查 用10%中性福爾馬林緩沖液對每只小鼠的腫瘤、肝臟和腎臟進(jìn)行快速固定，經(jīng)HE染色后，用石蠟進(jìn)行包埋，并切成厚度為5m的切片。在400倍顯微鏡下觀察腫瘤、肝臟和腎臟切片，并拍照記錄。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，組間差異采用單因素方差分析（one-way-ANOVA），組間兩兩比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。所有實驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果

2.1 ESP對HepG2細(xì)胞增殖抑制的影響

ESP干預(yù)24 h、48 h和72 h的細(xì)胞抑制率變化見圖1。ESP分別處理24 h、48 h和72 h后，HepG2細(xì)胞的IC50分別為75g/mL、64g/mL和62g/mL（均P＜0.001）；從用藥濃度看，同一時間的ESP對HepG2的增殖抑制作用呈劑量依賴性，其中以100g/mL抑制率為最高；從用藥時間看，同一濃度的ESP對HepG2的增殖抑制作用亦呈時間依賴性，其中以72 h抑制率為最高。

圖1 ESP分別干預(yù)24 h、48 h、72 h后對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.1 The inhibitory effect of ESP on the proliferation of HepG2 after 24 h and 48 h,72 h intervention

2.2 對荷瘤小鼠各項指標(biāo)的影響

各組荷瘤小鼠的體重、腫瘤重量以及肝、腎指數(shù)測定和計算結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠的體重、腫瘤重量和肝、腎指數(shù)Table 1 The body weight,tumor weight,liver index and kidney index of each group

對體重的影響：與正常組比較，各組小鼠體重及體重增加均無明顯差異；與模型組比較，各組小鼠體重及體重增加也無明顯差異；與CTX組比較，ESP各組的體重增加較多，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

對小鼠腫瘤重量的影響：從表中數(shù)據(jù)可見，模型組小鼠的重量最大。ESP各劑量組的腫瘤重量均低于模型組。其中，高、中劑量的ESP可顯著降低荷瘤小鼠的腫瘤重量（P＜0.01，P＜0.05），低劑量ESP干預(yù)的荷瘤小鼠的腫瘤重量雖小于模型組，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。通過腫瘤重量計算得到的腫瘤抑制率結(jié)果顯示，ESP低、中、高劑量組的抑制率呈現(xiàn)從低到高的趨勢，說明ESP的治療具有一定的劑量依賴性。

對肝、腎指數(shù)的影響：與正常組比較，CTX組小鼠的肝指數(shù)顯著上升（P＜0.001），說明接受CTX治療小鼠的肝受到較大影響；與模型組比較，ESP各組小鼠的肝、腎指數(shù)均有所降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明ESP對小鼠的肝、腎指數(shù)影響較??；與CTX組比較，ESP高、中、低劑量組小鼠的肝指數(shù)顯著降低（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01），說明ESP的肝毒性明顯弱于CTX。

2.3 ESP對小鼠細(xì)胞因子水平的影響

近年來的諸多研究表明，細(xì)胞因子具有廣泛的抗腫瘤活性。細(xì)胞因子TNF-、IL-2和VEGF與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移均具有密切的關(guān)系，不僅能夠直接刺激腫瘤部位的免疫效應(yīng)細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，而且能夠增強腫瘤細(xì)胞的識別能力[14，15]。其中，TNF-在一定濃度范圍內(nèi)具有組織修復(fù)功能，但TNF-濃度異常升高可引起組織損傷[16]。多類腫瘤細(xì)胞會產(chǎn)生TNF-，TNF-又進(jìn)一步刺激腫瘤生長[17]。由表2可知，模型組的TNF-水平明顯高于ESP各劑量組（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.01），表明模型組的TNF-濃度異常升高；經(jīng)過不同劑量的ESP干預(yù)后，TNF-水平顯著回調(diào)，且隨著劑量增加越接近于正常組水平，表明ESP可能通過回調(diào)異常升高的TNF-水平，減輕組織損傷，進(jìn)而改善機體在荷瘤狀態(tài)下的免疫細(xì)胞活性，抑制腫瘤生長；與模型組相比，ESP高、中劑量組的IL-2水平顯著升高（P＜0.001，P＜0.05），表明ESP可能通過刺激T淋巴細(xì)胞的增殖和活化來發(fā)揮抗癌作用[18]；與模型組相比，CTX組與ESP高、中劑量組VEGF水平均顯著降低（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.01），表明CTX和ESP能顯著抑制血清中VEGF的表達(dá)水平，并且可能通過有效減少腫瘤血管的生成來抑制腫瘤生長[19]。

表2 各給藥組對小鼠細(xì)胞因子水平的影響Table 2 The effect of each administration group on cytokine levels in mice

2.4 ESP對小鼠肝腎功能的影響

由表3可知，與正常組相比，模型組的AST、ALT、CRE和BUN的水平均顯著升高（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.01，P＜0.001）；經(jīng)CTX（P＜0.001）或ESP（P＜0.001）治療后，升高的水平可以顯著回調(diào)，其中ESP高劑量組的調(diào)節(jié)效果最好。上述結(jié)果表明，ESP表現(xiàn)出對肝臟的保護(hù)效果，而CTX雖然能夠顯著抑制腫瘤生長，但是對肝臟損害較大[20]。

表3 各給藥組對小鼠肝、腎功能的影響Table 3 The effect of each administration group on hepatic and renal function in mice

2.5 組織病理學(xué)檢查

通過HE染色，觀察腫瘤、肝臟和腎臟組織的病理變化（圖2）。腫瘤組織的切片結(jié)果顯示，模型組的腫瘤細(xì)胞呈不同形式的侵襲性生長，并且能夠檢測到有絲分裂活動和不同染色的腫瘤細(xì)胞[21]，而CTX組與ESP組中的大部分腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)壞死狀態(tài)。肝臟和腎臟組織的切片結(jié)果顯示，模型組的肝腎細(xì)胞空泡多，水腫，而CTX組與ESP組的肝腎細(xì)胞未見空泡和水腫，且細(xì)胞排列整齊、狀態(tài)良好[22]。上述結(jié)果說明ESP具有一定的抗腫瘤活性并且對小鼠的肝腎組織無明顯的毒副作用。

圖2 腫瘤、肝臟和腎臟組織的病理切片F(xiàn)ig.2 The histopathological studies of tumor,liver and kidney

3 討論

本研究利用人肝癌HepG2細(xì)胞株和H22肝癌荷瘤小鼠評估了美花風(fēng)毛菊乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位的體外和體內(nèi)抗肝癌效果。首先選用人肝癌HepG2細(xì)胞，以環(huán)磷酰胺為陽性對照藥，采用CCK-8法首次評價了ESP對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。研究結(jié)果表明，ESP具有顯著的體外抗腫瘤活性，且呈時間、劑量依賴關(guān)系。然后利用H22肝癌荷瘤小鼠模型，首次評價了ESP對腫瘤以及肝、腎組織的影響。研究結(jié)果表明，一方面，ESP具有顯著的體內(nèi)抗腫瘤活性并且可呈劑量依賴性地抑制腫瘤生長，同時可以增加TNF-和IL-2含量以及減少VEGF含量，提示ESP可能通過提高免疫能力、抑制腫瘤血管生成而發(fā)揮抗肝癌的作用；另一方面，ESP可顯著回調(diào)荷瘤小鼠的ALT、AST、BUN以及CRE含量，提示ESP可明顯緩解荷瘤小鼠的肝組織和腎功能損傷。

綜上所述，美花風(fēng)毛菊對肝癌具有抑制作用，并且可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的水平來發(fā)揮抗癌活性。與此同時，美花風(fēng)毛菊乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位還表現(xiàn)出對肝臟和腎臟的保護(hù)效果。但是目前缺乏對美花風(fēng)毛菊內(nèi)發(fā)揮抗癌活性的物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定以及抗癌機制的深入探討，因此，還需要進(jìn)行更多相關(guān)的研究，為美花風(fēng)毛菊的開發(fā)利用提供參考。