王瀟，胡國(guó)靜，隋新月，劉卉

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，山東 濟(jì)南 250014）

近年來(lái)，我國(guó)不孕癥的發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)，已成為嚴(yán)重影響女性身心健康、家庭和諧的疾病之一。導(dǎo)致不孕癥最為常見(jiàn)的原因是排卵障礙，約占所有原因的25%~50%[1]。排卵障礙性不孕癥（Ovulatory Disorder Infertility,ODI）是指由于女性生殖系統(tǒng)受到一些因素的影響導(dǎo)致排卵障礙，不能夠正常排卵，從而影響卵子與精子結(jié)合導(dǎo)致的不孕，常見(jiàn)的致病因素主要有下丘腦-垂體-卵巢軸（HPO軸）功能異常、卵巢病變、一些全身性疾病和心理因素等[2]。目前臨床治療以藥物為主，西醫(yī)使用以克羅米芬（CC）為代表的藥物進(jìn)行促排卵治療，此類(lèi)藥物可增加排卵率，但受孕率相對(duì)較低，且常產(chǎn)生流產(chǎn)、多胎妊娠和卵巢過(guò)度刺激綜合征等問(wèn)題[3,4]。因此找到一種促排卵效果好且副作用小的藥物具有重要意義。

羅勒（Basil）是唇形目唇形科羅勒屬植物，又名香菜、九層塔等，味辛、甘，性溫，歸胃、肺、脾、大腸經(jīng)，為藥食兩用芳香植物，是一種常見(jiàn)易得的藥材[5]。經(jīng)臨床觀察，羅勒促排卵的效果顯著[6]，但其分子機(jī)制尚未明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門(mén)新學(xué)科，其整體性、系統(tǒng)性和注重藥物間相互作用的特點(diǎn)與中醫(yī)藥學(xué)的辨證論治和整體觀念相吻合，能從生物學(xué)系統(tǒng)層面揭示藥物與靶點(diǎn)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作用，是研究傳統(tǒng)中藥與現(xiàn)代藥理學(xué)之間相互關(guān)系的橋梁[7-9]。研究旨在通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探尋羅勒治療排卵障礙性不孕癥的有效成分及作用靶點(diǎn)，并分析其生物過(guò)程及信號(hào)通路，進(jìn)而闡述其作用機(jī)制，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 羅勒化學(xué)成分及靶點(diǎn)獲取

基于中醫(yī)藥研究綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMID）及相關(guān)文獻(xiàn)[10]獲取羅勒的化學(xué)成分，將文獻(xiàn)中成分在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）中根據(jù)類(lèi)藥性（DL）≥0.18及口服生物利用度（OB）≥30%篩選，使用有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(kù)（PubChem）獲得上述成分的SDF結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入生物活性小分子靶向預(yù)測(cè)平臺(tái)（Swiss Target Prediction）獲得藥物靶點(diǎn)。

1.2 ODI疾病靶點(diǎn)獲取

以“Ovulatory Disorder Infertility”為關(guān)鍵詞，使用在線人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM）及人類(lèi)基因綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（GeneCards）分別進(jìn)行檢索，去重后，獲得ODI疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 羅勒治療ODI的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)利用Venny 2.1取交集，得到羅勒與ODI的共同靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖。通過(guò)Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“羅勒-有效成分-ODI-靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，并使用軟件中Network Analyzer功能進(jìn)行分析，根據(jù)節(jié)點(diǎn)自由度（Degree）將有效成分排序。

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)

將韋恩圖中得到的藥物-疾病共同靶點(diǎn)輸入蛋白互作平臺(tái)（STRING）中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，設(shè)置最低相互作用閾值為0.4，蛋白種類(lèi)為“Homo sapiens”，獲取羅勒治療ODI靶點(diǎn)的互作關(guān)系，將得到的TSV格式文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行再現(xiàn)美化與拓?fù)洚悩?gòu)分析，選擇Degree值≥25進(jìn)行篩選，獲得羅勒治療ODI的核心靶點(diǎn)。

1.5 富集分析

將藥物-疾病共同靶點(diǎn)上傳至功能富集分析數(shù)據(jù)庫(kù)（DAVID），物種及背景設(shè)置為“Homo sapiens”，進(jìn)行靶點(diǎn)基因的基因本體論（GO）與京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）功能富集分析，并將結(jié)果以圖的形式呈現(xiàn)。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

使用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)下載有效成分結(jié)構(gòu)，使用AutodockTools 1.5.6對(duì)配體小分子加氫、加電荷、檢測(cè)配體的root、進(jìn)行可旋轉(zhuǎn)鍵的搜尋與定義并保存為pdbqt文件。RCSB Protein Data Bank數(shù)據(jù)庫(kù)下載核心靶點(diǎn)蛋白的三維結(jié)構(gòu)，使用AutodockTools1.5.6軟件添加氫原子、計(jì)算Gasteiger電荷、合并非極性氫后將其定義為受體并保存成pdbqt文件。確定Vina分子對(duì)接的坐標(biāo)和盒子大小，最后運(yùn)用Autodock vina 1.1.2對(duì)有效成分與核心靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行半柔性對(duì)接。

2 結(jié)果

2.1 成分及靶點(diǎn)篩選

通過(guò)TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索得到羅勒含有的15個(gè)化合物，分別是(+)-car-3-ene-2,5-dione、2-呋喃羧酸（2-Furancarboxylic Acid）、茴香腦（Anethole）、雙環(huán)水芹烯（Bicyclosesquiphellandrene）、carene-3、D-n-甲基椰油堿（D-n-methyl coclaurine）、桉樹(shù)腦（Eucalyptol）、桉樹(shù)蠟（Eucalyptus wax）、丁子香酚（Eugenol）、丁子香酮（Eugenone）、異櫟素（Isoquercitrin）、肉桂酸甲酯（Methylcinnamate）、對(duì)甲氧基肉桂酸（P-Methoxycinnamic Acid）、對(duì)甲氧基肉桂醛（P-methoxycinnamaldehyde）和黃樟素（Safrole）；文獻(xiàn)中獲得羅勒化合物37個(gè)，其中符合TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)的化合物2個(gè)，分別為槲皮素（Quercetin）、山柰酚（Keampferol）。通過(guò)Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出374個(gè)藥物靶點(diǎn)。

2.2 潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

將ODI分別在OMIM、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，篩選去重后獲得疾病靶點(diǎn)977個(gè)。將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)輸入Venny 2.1，繪制韋恩圖，兩者取交集后獲得藥物-疾病共同靶點(diǎn)53個(gè)，分別為PGR、AR、SERPINA6、SHBG、CYP17A1、CYP19A1、PTGES、ESR1、ESR2、MCL1、FAAH、HSD11B2、PTGS1、NOS2、AHR、F3、PTGS2、PPARA、SLC6A4、DRD2、DRD4、ADRB2、DRD5、OPRM1、TBXA2R、HTR2A、JUN、VEGFA、SRD5A1、KDR、TTR、MPI、PTPN22、MAPK10、MPO、CCND1、PDE3A、CYP11B1、MMP2、MMP14、CDK4、NOX4、TNF、IL2、MMP9、MMP1、NR4A1、HSD11B1、CASP3、HTT、NOS1、ALB和SLC16A7，見(jiàn)圖1。

2.3 “羅勒-有效成分-ODI-靶點(diǎn)”相互作用的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將整理好的羅勒化學(xué)成分與藥物-疾病共同靶點(diǎn)數(shù)據(jù)上傳至Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建“羅勒-有效成分-ODI-靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖2。圖中藍(lán)色三角形代表羅勒中的15種有效成分（2種化學(xué)成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)無(wú)交集，予刪除），綠色六邊形代表53個(gè)共同靶點(diǎn)。Degree值表示預(yù)測(cè)出該成分與作用靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)個(gè)數(shù)，Degree值越大說(shuō)明該成分越重要，以Degree值從大到小排名依次是(+)-car-3-ene-2,5-dione、D-n-甲基椰油堿（D-n-methyl coclaurine）、丁子香酮（Eugenone）、丁子香酚（Eugenol）、對(duì)甲氧基肉桂酸（P-Methoxycinnamic Acid）、carene-3、肉桂酸甲酯（Methylcinnamate）、槲皮素（Quercetin）、雙環(huán)水芹烯（Bicyclosesquiphellandrene）、異櫟素（Isoquercitrin）、茴香腦（Anethole）、黃樟素（Safrole）、對(duì)甲氧基肉桂醛（Pmethoxycinnamaldehyde）、桉樹(shù)蠟（Eucalyptus wax）和桉樹(shù)腦（Eucalyptol）。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將疾病-藥物共同靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取TSV格式文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件繪制關(guān)鍵靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。圓圈越大、顏色越深代表關(guān)聯(lián)度越大，在此網(wǎng)絡(luò)中，度值大于25的靶點(diǎn)為ALB（Degree=36）、TNF（Degree=32）、VEGFA（Degree=30）、PTGS2（Degree=30）和JUN（Degree=27）。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 The PPI network analysis

2.5 富集分析

GO富集結(jié)果顯示，交集基因共富集至158條生物學(xué)過(guò)程（Biological Process,BP）中，主要包括對(duì)缺氧的反應(yīng)、對(duì)藥物的反應(yīng)、ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)的正調(diào)控、氧化還原過(guò)程、血壓負(fù)調(diào)節(jié)、糖皮質(zhì)激素生物合成過(guò)程、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、乳腺肺泡發(fā)育、RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、內(nèi)皮細(xì)胞增殖的正調(diào)控等；23條細(xì)胞組分表達(dá)過(guò)程（Cellular Component,CC）中，主要包括膜筏、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和質(zhì)膜的組成部分等；46條與分子功能相關(guān)的過(guò)程（Molecular Function,MF）中，主要包括類(lèi)固醇結(jié)合、血紅素結(jié)合、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子活性和配體激活的序列特異性DNA結(jié)合等。根據(jù)P值，將顯著性排名靠前的條目進(jìn)行可視化，見(jiàn)圖4。KEGG通路分析主要涉及39條通路，根據(jù)P值，將顯著性排名前20的條目進(jìn)行可視化，見(jiàn)圖5。KEGG顯示，羅勒治療ODI的作用機(jī)制主要涉及激素調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等，相關(guān)通路包括TNF信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、卵巢類(lèi)固醇生成、GnRH信號(hào)通路和PI3K-Akt信號(hào)通路等，這提示羅勒通過(guò)多通路來(lái)治療ODI。

圖4 GO富集分析圖Fig.4 The GO enrichment analysis

圖5 KEGG富集分析前20條通路Fig.5 The first 20 pathways of KEGG enrichment analysis

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果

通過(guò)將PPI網(wǎng)絡(luò)圖中度值前5的靶點(diǎn)ALB、TNF、VEGFA、PTGS2和JUN與15個(gè)有效成分進(jìn)行分子對(duì)接，整理得到分子對(duì)接打分結(jié)果，見(jiàn)表1。結(jié)合自由能可以評(píng)估受體和配體之間的親和性，一般認(rèn)為結(jié)合能小于0時(shí)，配體和受體可以自由結(jié)合，且結(jié)合自由能越低，二者親和力越強(qiáng)。結(jié)果顯示，羅勒有效成分均與網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶點(diǎn)具有較好結(jié)合活性，驗(yàn)證了本研究數(shù)據(jù)的可靠性，運(yùn)用PyMOL軟件對(duì)靶點(diǎn)基因結(jié)合活性最強(qiáng)有效成分對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化，見(jiàn)圖6。

圖6 槲皮素與PTGS2的分子對(duì)接構(gòu)象圖Fig.6 The molecular docking conformation diagram of quercetin and PTGS2

表1 有效成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)合自由能表Table 1 Table of molecules docking and binding free energy between the effective components and core targets

3 討論

中醫(yī)藥治療不孕癥歷史悠久，早在《素問(wèn)·骨空論》中就提出“督脈者……此生病……其女子不孕”。不孕癥是指未避孕、有正常性生活、夫婦同居一年而未受孕者。未避孕而從未妊娠者稱(chēng)為原發(fā)性不孕癥，古稱(chēng)全不產(chǎn)；曾有過(guò)妊娠而后未避孕連續(xù)一年未妊娠者稱(chēng)為繼發(fā)性不孕癥，古稱(chēng)斷續(xù)[11]。祖國(guó)醫(yī)學(xué)在治療不孕癥方面有著療效好、副作用小的優(yōu)勢(shì)。目前我國(guó)臨床以中藥復(fù)方促排卵居多，對(duì)于單味中藥促排卵的研究較少。金維新等[12]使用羅勒膠囊（治療組）治療女性排卵功能障礙性不孕癥，妊娠率高于克羅米芬組（對(duì)照組），且流產(chǎn)率更低。本文旨在通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)一步揭示羅勒在分子層面的促排卵作用，為臨床應(yīng)用及新藥開(kāi)發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

羅勒治療排卵障礙性不孕癥的最主要有效化合物為槲皮素、異櫟素和茴香腦。槲皮素為具有多種生物活性的黃酮醇類(lèi)化合物，影響卵泡發(fā)育及排卵過(guò)程，通過(guò)降低HPO軸中ER、ER和PR的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)血清中卵泡刺激素和黃體生成素分泌水平[13]。異櫟素是一種常見(jiàn)的食用植物雌激素，已知能抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1，在人體內(nèi)與雌二醇的作用相當(dāng)[14]。茴香腦可調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞和胚胎中氧化還原平衡和改善線粒體功能，促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育，從而促進(jìn)排卵[15]。

羅勒主要通過(guò)TNF（腫瘤壞死因子）、PTGS2（前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2）、PGR（孕酮受體）、VEGFA（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A）、ESR1（雌激素受體1）和CYP19A1（細(xì)胞色素P450 19A1）等靶點(diǎn)作用于排卵障礙性不孕癥。除抗腫瘤外，TNF還可以誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞和早期卵泡凋亡，破壞血管內(nèi)皮，影響卵巢供血、激素分泌和卵泡發(fā)育[16]。促性腺激素激增觸發(fā)排卵，促性腺激素激增可誘導(dǎo)排卵前卵泡顆粒細(xì)胞中兩個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)，即PGR和PTGS2，它們分別激活兩個(gè)獨(dú)立的通路，這兩個(gè)通路對(duì)成功排卵都是必不可少的，并且PGR發(fā)揮了一個(gè)額外的重要作用，可通過(guò)減少促性腺激素激增誘導(dǎo)的PTGS2表達(dá)來(lái)減輕排卵性炎癥[17]。卵泡發(fā)育依賴(lài)于卵巢血管的生成，VEGFA是重要的調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)的因子，由其介導(dǎo)的血管生成對(duì)于卵巢卵泡的周期性生長(zhǎng)和發(fā)育具有重要影響[18,19]。ESR1被認(rèn)為是卵泡發(fā)育和成熟過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵基因，ESR1能夠編碼一種雌激素受體，通過(guò)結(jié)合雌激素配體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[20]。CYP19A1是芳香化酶P450（P450arom）的編碼基因，P450arom在卵泡募集的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，可使雄烯二酮轉(zhuǎn)化為雌二醇，并且刺激自身受體及黃體生成素受體的合成，也是卵巢內(nèi)部局部調(diào)節(jié)機(jī)制中的重要因素之一[21]。由此可知羅勒主要通過(guò)調(diào)節(jié)與排卵相關(guān)的激素和減輕排卵性炎癥，起到促排卵作用。

根據(jù)GO富集分析提示羅勒治療排卵障礙性不孕癥主要涉及對(duì)缺氧的反應(yīng)、氧化還原過(guò)程、對(duì)藥物的反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞增殖的正調(diào)控、對(duì)脂多糖的反應(yīng)等生物過(guò)程。KEGG富集通路分析顯示，關(guān)鍵靶點(diǎn)主要富集在激素調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等通路，包括TNF、雌激素、卵巢類(lèi)固醇生成、GnRH和PI3K-Akt信號(hào)通路等。雌激素信號(hào)通路發(fā)揮其作用通過(guò)激活細(xì)胞質(zhì)中的激酶，或者雌激素與雌激素受體結(jié)合后調(diào)節(jié)細(xì)胞核中的基因轉(zhuǎn)錄[22]，羅勒可通過(guò)調(diào)控雌激素信號(hào)通路調(diào)節(jié)雌激素的分泌來(lái)影響排卵的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。促性腺激素釋放激素（GnRH）是生殖過(guò)程中最重要的激素之一，由下丘腦合成并以脈沖方式釋放，誘導(dǎo)促性腺激素—促黃體素和卵泡刺激素的合成和分泌。PI3K-AKT信號(hào)通路與卵巢顆粒細(xì)胞凋亡有關(guān)，多囊卵巢綜合征（PCOS）是排卵障礙不孕癥的主要類(lèi)型之一，多囊患者子宮內(nèi)膜常存在P13K-Akt信號(hào)通路的過(guò)度活化[23,24]。

綜上所述，羅勒治療排卵障礙不孕癥是通過(guò)多成分多靶點(diǎn)多通路發(fā)揮作用的，通過(guò)調(diào)節(jié)關(guān)鍵靶點(diǎn)TNF、PTGS2、PGR、VEGFA、ESR1和CYP19A1的表達(dá)以及多種生物過(guò)程，最終作用于炎癥反應(yīng)及激素調(diào)節(jié)等相關(guān)通路，從而達(dá)到對(duì)排卵障礙性不孕癥的治療目的。本研究因數(shù)據(jù)有限，有一定局限性，但仍希望為排卵障礙性不孕癥的治療提供新思路。