楊 寶，郭 星，鄭 巍，朱殿龍，裴社強，鄧自新，張 燁，李 靜

（1.太原市食品藥品檢驗所，山西太原 030006；2.山西省食品藥品檢驗所，山西太原 030006；3.大連市檢驗檢測認證技術(shù)服務(wù)中心，遼寧大連 116021；4.山西省食品檢驗技術(shù)研究院，山西太原 030012）

0 引言

酸棗仁為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟種子[1]。在我國主要產(chǎn)地為山西、河北、遼寧、內(nèi)蒙古、陜西、山東。酸棗仁具有養(yǎng)心補肝、寧心安神、斂汗、生津的藥效[2]。酸棗仁無毒副作用，是我國35 種貴重中藥材之一，也是最早進入藥食同源品種目錄的中藥材之一[3]。近年來，隨著酸棗仁野生資源的減少，需求量增加，價格上漲，市場上出現(xiàn)以滇刺棗（Ziziphus mauritiana Lam.）、枳椇子（Hoveni adulcis Thunb.）、兵豆（Lens culinaris Medic.）、紫荊（Cercis chinensis Bge.）的種子摻雜摻偽的現(xiàn)象[4]。其中，理棗仁與酸棗仁性狀極為相似，炒制和染色后更加難以區(qū)分，但價格僅為酸棗仁1/4，與酸棗仁性狀極為相似，理棗仁成為酸棗仁最常見的偽品。其余3 個品種偽品由于性狀上差異較大，極少作為摻偽品種。理棗仁為云南省中藥飲片標準品種，國內(nèi)其他省份沒有明確規(guī)定禁止使用，各省市場均有流通，但無論從傳統(tǒng)功效、化學成分、藥理作用上2 種中藥材均存在差異[5]，混用誤用都不利于藥效的發(fā)揮。因此，建立更加快速、可靠、操作簡單的酸棗仁鑒別方法對于保護中藥材種植戶權(quán)益、保障酸棗仁藥材的質(zhì)量及用藥安全具有重要意義。

目前，對于酸棗仁的鑒別研究多采用藥材性狀[6]、顯微特征[7]、薄層色譜[8]、電泳[9-10]、紫外光譜[11-12]、掃描電鏡[13]等傳統(tǒng)鑒別方法。近年來，分子生物學檢測技術(shù)從基因水平對酸棗仁及其偽品進行鑒定，與常規(guī)檢測方法相比，其具有特異性強、靈敏度高、有效降低污染率、連續(xù)快速、操作簡單易于掌握等特點，已報道的有DNA 條形碼[14-16]、普通PCR 檢測技術(shù)[17]實時多重實時熒光PCR 技術(shù)在酸棗仁及其常見偽品理棗仁真?zhèn)舞b定方面尚無相關(guān)報道。李桂林等人[17]開發(fā)的PCR 檢測方法，僅能鑒別出是否是酸棗仁正品，不能在同一反應(yīng)體系同時鑒別酸棗仁及其偽品理棗仁。實時熒光PCR 檢測技術(shù)操作簡便，無需電泳即可自動化獲得檢測結(jié)果，并進行快速定性定量分析[18-20]。而多重實時熒光PCR 通過檢測不同的熒光信號還可以在一次反應(yīng)中同時檢測多種靶點，實現(xiàn)快速高通量的檢測[21-23]。

擬采用基于Taqman 多重實時熒光PCR 方法對中藥材酸棗仁中摻偽成分進行鑒別和檢測，針對酸棗仁及其常見摻偽成分理棗仁，設(shè)計不同熒光標記特異性探針，建立主成分酸棗仁及常見摻偽成分理棗仁的雙重實時熒光PCR 檢測方法，形成高靈敏度、高特異性和高通量的酸棗仁及其制品摻偽成分理棗仁的快速檢測技術(shù)。彌補市場對于酸棗仁中藥材檢測技術(shù)的缺口和需求，為市場、生產(chǎn)企業(yè)和監(jiān)管部門提供精準、快速、高效率、高通量的基因組學檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

共收集酸棗仁樣品14 份，理棗仁樣品10 份，枳椇子、紫荊子、兵豆各1 份，樣品產(chǎn)地及來源于河北安國、安徽亳州、廣西玉林、大連市檢驗檢測認證技術(shù)服務(wù)中心、太原市藥店和飲片生產(chǎn)企業(yè)等地，由大連市檢驗檢測認證技術(shù)服務(wù)中心朱殿龍副主任藥師鑒定。

樣品信息見表1。

表1 樣品信息

1.2 試劑與設(shè)備

香港力康Neofuge 13R 高速冷凍離心機；Eppendorf 微量核酸分析儀；美國熱電ABI7500fast 熒光定量PCR 儀；BIO-RAD C1000 TOUCH 梯度PCR儀；Power Pac Basic 電泳儀；美國伯樂凝膠成像系統(tǒng)；植物基因組DNA 提取試劑盒（TIANGEN，Cat#305）；上海生工生物公司合成的引物、探針；TaqManTMMultiplex Master Mix（ABI，NO.4461881）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品DNA 提取

為了避免污染，樣品用75%酒精棉球?qū)⒈砻娌潦酶蓛?、晾干，用球磨儀粉碎成細粉狀，稱取20 mg置于滅菌的2 mL 離心管中。采用TIANGEN 提取試劑盒提取樣本DNA，用核酸分析儀測定DNA 的純度及質(zhì)量濃度，將OD260/OD280 在1.7～1.9，且質(zhì)量濃度達到10～100 ng/μL 的DNA 溶液作為模板DNA，-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 ITS2 引物PCR 擴增檢測測序

將樣品DNA 用ITS2 通用引物進行PCR 擴增，反應(yīng)體系20 μL（見表2）。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40 個循環(huán)，72 ℃延伸5 min，12 ℃下保存。進行瓊脂糖凝膠檢測，觀察是否能夠產(chǎn)生擴增條帶，將擴增成功的樣品進行測序。

反應(yīng)體系配制見表2。

表2 反應(yīng)體系配制

1.3.3 引物的設(shè)計與擴增

引物的設(shè)計：通過檢索NCBI 的數(shù)據(jù)庫和查閱文獻后獲得酸棗仁、理棗仁及其他常見近源物種序列結(jié)合1.3.2 測序結(jié)果，使用NCBI 的Primer-Blast，用Snap gene 軟件比對，設(shè)計出能夠用于酸棗仁及其偽品真?zhèn)舞b別的實時熒光PCR 檢測引物和探針，探針分別使用不同的熒光標記，由上海生工生物公司合成。

酸棗仁及理棗仁正向引物：5'-GCCGCAGCAA TCGGTGG-3'；

酸棗仁反向引物：5'-TATTTCGGCCAGCCGCGG-3'；

理棗仁反向引物：5'-CGTTTCGGCCAGCCGCGA-3'；

酸棗仁探針：5'FAM-ACCTCGACCTCGAGGCGAAGAG-3'BHQ1；

理棗仁探針：5'-VIC-AACCTCCGCCTCGGAAGG G-3'BHQ1。

反應(yīng)體系配制見表3。

表3 反應(yīng)體系配制

反應(yīng)條件為：50 ℃2 min；95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，40 個循環(huán)。

1.3.4 特異性試驗

將1.3.1 中提取的酸棗仁樣品、理棗仁樣品及其他樣品的DNA 作為模板。按照上述反應(yīng)體系和條件進行擴增，以水作為空白對照，驗證引物和探針對酸棗仁、理棗仁樣品擴增的特異性。

1.3.5 樣品覆蓋度試驗

將14 批酸棗仁DNA、10 批理棗仁DNA 為模板，按照1.3.3 進行擴增，以水作為空白對照，進行覆蓋度試驗。

1.3.6 靈敏度試驗

酸棗仁DNA 模板和理棗仁DNA 模板各取50 ng，分別10 倍遞減稀釋，至10-4，每個梯度做5 個平行試驗，按照1.3.3 中反應(yīng)體系和條件擴增，測試雙重實時熒光PCR 方法的絕對靈敏度。

1.3.7 混合樣本檢測

中國藥典2020 年版四部規(guī)定，藥屑及雜質(zhì)通常不得超過3%[24]，在酸棗仁DNA 模板中分別摻入50%，20%，10%，5%，3%，1%的理棗仁DNA 模板，對上述樣品充分混勻，混合樣品的DNA 質(zhì)量濃度在10～40 ng/μL，每個樣品做2 個平行，檢測樣品是否摻入了偽品理棗仁，驗證檢測方法是否能夠應(yīng)用于樣品摻入偽品的檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性試驗

酸棗仁特異性擴增圖譜見圖1。

由圖1 可知，非酸棗仁類樣品無明顯的FAM 熒光對數(shù)擴增曲線，Ct 值均大于40；酸棗仁樣品有FAM熒光信號檢出，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，Ct 值小于35。

圖1 酸棗仁特異性擴增圖譜

理棗仁特異性擴增圖譜見圖2。

由圖2 可知，非理棗仁類樣品無明顯的VIC 熒光對數(shù)擴增曲線，Ct 值均大于40；理棗仁樣品有VIC 熒光信號檢出，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，Ct 值小于35。

圖2 理棗仁特異性擴增圖譜

以酸棗仁及其偽品理棗仁為研究對象，設(shè)計和篩選了2 種中藥材特異性引物探針，擴增結(jié)果顯示只有對應(yīng)靶標物種產(chǎn)生熒光對數(shù)擴增曲線，擴增Ct值在12～14，與非靶標物種之間未產(chǎn)生擴增反應(yīng)，說明篩選的引物探針特異性較好。

2.2 樣品覆蓋度試驗

酸棗仁樣品擴增圖譜見圖3，理棗仁樣品擴增圖譜見圖4。

圖3 酸棗仁樣品擴增圖譜

由圖3 和圖4 可知，經(jīng)實時熒光PCR 擴增，14酸棗仁樣品和10 批理棗仁樣品在40 個循環(huán)中均相應(yīng)的熒光對數(shù)擴增曲線，酸棗仁樣品擴增Ct 值在12～24，理棗仁樣品Ct 值擴增Ct 值在10～22 均小于40。雙重實時熒光PCR 檢測方法可以有效檢測出相應(yīng)靶標物熒光信號，該方法適用于市場上酸棗仁及其偽品理棗仁的鑒別。

圖4 理棗仁樣品擴增圖譜

2.3 絕對靈敏度試驗

酸棗仁樣品靈敏度擴增圖譜見圖5，酸棗仁樣品靈敏度擴增標準曲線見圖6。

圖5 酸棗仁樣品靈敏度擴增圖譜

圖6 酸棗仁樣品靈敏度擴增標準曲線

由圖5 可知，酸棗仁樣品在稀釋度10-4～100時，Ct 值均＜35，有明顯的對數(shù)擴增曲線，擴增結(jié)果具有良好的重復(fù)性，相對標準偏差RSD 均＜3.5%。以稀釋度量值對Ct 值作圖。由圖6 可知，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.997，線性方程為Y=-3.564X+15.94，線性范圍為5 pg～50 ng，即5～50 ng/反應(yīng)，該方法具有良好的線性相關(guān)度。該方法靈敏度高達5 pg/反應(yīng)。

理棗仁樣品靈敏度擴增圖譜見圖7，理棗仁樣品靈敏度擴增標準曲線見圖8。

圖7 理棗仁樣品靈敏度擴增圖譜

圖8 理棗仁樣品靈敏度擴增標準曲線

由圖7 可知，理棗仁樣品在稀釋度10-4～100時，Ct 值均＜35，有明顯的對數(shù)擴增曲線，擴增結(jié)果具有良好的重復(fù)性，相對標準偏差RSD 均＜3.5%。以稀釋度量值對Ct 值作圖。由圖8 可知，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.992，線性方程為Y=-3.321X+17.005，線性范圍為5 pg～50 ng，即5～50 ng/反應(yīng)，該方法具有良好的線性相關(guān)度，靈敏度高達5 pg/反應(yīng)。

2.4 偽品理棗仁實際檢出限

為了進一步分析雙重實時熒光PCR 反應(yīng)體系對酸棗仁摻入偽品理棗仁檢測的實際靈敏度，結(jié)合市售樣品實際摻偽情況，在酸棗仁DNA 模板中分別摻入50%，20%，10%，5%，3%，1%（W/W）的偽品DNA 模板，雙重實時熒光PCR 檢測結(jié)果顯示，樣品中同時存在酸棗仁和理棗仁2 種親源關(guān)系相近的物種DNA，混合體系出現(xiàn)了交叉反應(yīng)。由圖9 可知，偽品理棗仁樣品的最低檢出限可達3%（W/W），檢測Ct 值在24 左右，可以滿足藥典規(guī)定雜質(zhì)含量檢測需求。因此，確定該方法可用于實際中藥材酸棗仁樣品中理棗仁摻偽檢測。

理棗仁摻偽檢測結(jié)果見圖9。

圖9 理棗仁摻偽檢測結(jié)果

3 討論

近年來，由于酸棗仁中藥材野生資源有限，存在著偽品和混淆品現(xiàn)象，在染色和炒制后，更加不易區(qū)分。傳統(tǒng)鑒別方法往往是通過外觀性狀，如眼觀、手摸、鼻聞、口嘗等，必要時借助顯微觀察和薄層鑒別，這種鑒別方式對檢驗人員的專業(yè)素質(zhì)要求較高，而且存在主觀差別，不適用于快速、準確、廣泛地推廣。理化檢測方法專屬性不強、操作繁瑣、耗時長、檢測分析成本較高。2020 年版中國藥典收錄了PCR-RFLP 方法鑒別川貝母、霍山石斛，PCR方法鑒別烏梢蛇和蘄蛇及金錢白花蛇，也首次制定了聚合酶鏈式反應(yīng)的指導(dǎo)原則，隨著中藥材制假售假的手段不斷提高，分子生物學檢測方法必將成為重要的檢測手段。

ITS 作為真核生物核糖體DNA 的非編碼區(qū)，承受的選擇壓力較小，物種間差異較大，遺傳信息較豐富，片段長度適宜，有利于找到特異性的靶標片段，所以ITS 分子標記被廣泛應(yīng)用于中藥材的鑒定中。通過試驗證實該方法特異性好、能夠同時檢測正偽品成分、靈敏度高，檢測核酸含量可達pg 級。研究同時發(fā)現(xiàn)，酸棗仁與理棗仁在ITS2 片段上同源性達到了94%以上，差異位點少，設(shè)計引物探針難度大，兩物種上游引物采用兩物種共有引物序列，在探針上游很難找到差異位點，偽品理棗仁實際檢出限試驗結(jié)果顯示，兩物種混合樣品實時熒光PCR擴增出現(xiàn)了交叉反應(yīng)，擴增反應(yīng)被抑制，但實際檢出限仍然能達到3%，能夠滿足中國藥典摻入雜質(zhì)檢測要求。

4 結(jié)論

基于ITS 分子標記，分別設(shè)計了特異性鑒別酸棗仁和理棗仁的引物和TaqMan 探針，在40 個循環(huán)內(nèi)酸棗仁和理棗仁樣品均有相應(yīng)的熒光對數(shù)擴增曲線，其他物種樣品無熒光對數(shù)擴增曲線，利用多重多色實時熒光PCR 技術(shù)，一管反應(yīng)同時鑒別酸棗仁、偽品理棗仁，大大提高了檢測效率和實用性；經(jīng)實際市售酸棗仁和理棗仁樣品的檢測驗證了其可行性和適用性；整個試驗2～3 h，用時較短、靈敏度較高、整個過程閉管操作，降低了出現(xiàn)假陽性的概率，同時也避免了有毒有害物質(zhì)對環(huán)境和操作員的傷害；試驗結(jié)果由儀器判讀，更加準確，減小了檢驗人員判讀時的主觀誤差。該方法操作簡單可快速掌握，檢測結(jié)果與性狀鑒定結(jié)果完全一致，在酸棗仁生產(chǎn)加工質(zhì)量監(jiān)控及監(jiān)管部門監(jiān)管中具有很高的應(yīng)用價值。