黃菲菲，王輝，高翔，黃仲略，蘇華俊，曹建雷

1.武漢市蔡甸區(qū)人民醫(yī)院，湖北 武漢 430100； 2.武漢大學(xué)中南醫(yī)院，湖北 武漢 430000

心力衰竭是指心臟舒張或收縮功能障礙，不能充分排出靜脈回心血量，導(dǎo)致動脈血液灌注不足，靜脈血液淤積，繼而引發(fā)心臟循環(huán)障礙。心力衰竭不是一種獨(dú)立的疾病，而是各類心臟疾病發(fā)展的終末階段。心肌重構(gòu)是心力衰竭的重要病理機(jī)制，主要表現(xiàn)有心肌纖維化、心腔擴(kuò)大、心肌肥厚等[1-2]。研究表明，心力衰竭發(fā)生時會伴隨心肌細(xì)胞凋亡，該癥狀與心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷、線粒體功能障礙有密切關(guān)聯(lián)[3-5]。心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)越強(qiáng)，機(jī)體抗氧化能力越弱，氧化還原失衡就越嚴(yán)重。線粒體功能障礙可能導(dǎo)致氧化磷酸化不足，從而增加氧化應(yīng)激中間產(chǎn)物，加強(qiáng)對心肌細(xì)胞的損害，其動力學(xué)平衡機(jī)制可能與Wnt/β-catenin通路相關(guān)[6]。因此，探索心肌損傷發(fā)生的主要機(jī)制并研究保護(hù)心臟功能的相關(guān)藥物一直是臨床研究的一項重要課題。麝香保心丸是心內(nèi)科臨床常用藥物，具有改善冠狀動脈血流量，減輕心肌纖維化等功效，同時可以強(qiáng)心益氣，改善患者的心功能[7]，但具體作用機(jī)制尚不明確。本研究旨在觀察麝香保心丸對冠狀動脈粥樣硬化性心臟病心力衰竭心肌損傷、心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響，并探究其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物90只健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量240～260 g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司，合格證號：SYXK(川)2014-189。飼養(yǎng)于室溫22～24 ℃，相對濕度50%，自然光照，自由飲水。

1.2 藥物與試劑麝香保心丸(上海和黃藥業(yè)有限公司，批號：101435)；卡托普利片(石家莊科迪藥業(yè)有限公司，批號：2015526)。腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)試劑盒(上海奧陸生物科技有限公司，批號：F8185-A)；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，貨號：SNM536-VFE)；活性氧(reactive oxygen species，ROS)試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司，貨號：JKSJ-1834)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司，貨號：JKSJ-1892)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司，貨號：JKSJ-1821)；谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司，貨號：JK-2396)；PrimeScriptTM RT reagent Kit(日本TaKaRa，批號：RR420A)；戊巴比妥鈉(上海紫一試劑廠，貨號：57-33-0)；40 ng·L-1多聚甲醛(西安百螢生物科技有限公司，貨號：20010)；蛋白酶K(美國 Sigma-Aldrich公司，貨號：3450-01-6)。

1.3 儀器ALC-V8S型小動物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物科技有限公司)；FX7202型心電圖機(jī)(日本福田)；Vevo2011型小動物超聲實(shí)時影像系統(tǒng)(加拿大Visual Sonics公司)；ES-2型紫外分光光度儀(日本Malcom公司)；LightCycler 2.0型PCR儀(羅氏設(shè)備有限公司)；DM3000型光學(xué)顯微鏡(德國Leica公司)。

2 方法

2.1 大鼠造模與分組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)選擇15只大鼠為假手術(shù)組，其余75只大鼠復(fù)制心力衰竭模型。腹腔注射3%戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)對大鼠進(jìn)行麻醉，將其仰臥位固定在手術(shù)臺上，在大鼠頸部做一切口進(jìn)行插管并連接動物呼吸機(jī)，四肢皮下插入動物機(jī)能電極，進(jìn)行心電監(jiān)測，然后結(jié)扎左冠狀動脈前降支，心電圖顯示T波增高甚至與QRS波融合視為造模成功[8-9]。假手術(shù)組僅切開胸膛，但不結(jié)扎左冠狀動脈前降支。造模4周后對大鼠進(jìn)行分組，剔除造模失敗大鼠，各組均保留14只，隨機(jī)分為卡托普利(135 mg·kg-1)組、麝香保心丸(低、中、高劑量)(25 mg·kg-1、50 mg·kg-1、75 mg·kg-1)組與模型組。假手術(shù)組、模型組用相應(yīng)體積的生理鹽水進(jìn)行灌胃，每日1次，連續(xù)治療4周。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 心臟形態(tài)學(xué)的檢測采用小動物超聲實(shí)時影像系統(tǒng)檢測大鼠心臟體積變化情況。將大鼠固定在解剖臺上并用異氟烷進(jìn)行麻醉，對大鼠進(jìn)行心臟定位，并通過M模式超聲評價大鼠心臟功能。檢測大鼠左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension，LVDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic dimension，LVDs)、左心室舒張末期容積(left ventricular end-diastolic volume，LVEDV)、左心室收縮末期容積(left ventricular end-systolic volume，LVESV)，所有數(shù)據(jù)均選取3個測量值的平均值。

2.2.2 血漿BNP水平的檢測每組隨機(jī)選擇10只大鼠，用含EDTA的抗凝管進(jìn)行腹主動脈取血，靜置30 min后，離心(3 500 r·min-1，10 min)，取上清，采用放射免疫法檢測血漿BNP水平。

2.2.3 心臟質(zhì)量指數(shù)(total heart mass index，HWI)的測定取血后，打開大鼠腹腔，摘取大鼠心臟，并用濾紙吸干水分，稱取心臟質(zhì)量(heart mass，HM)，并計算HWI[HWI=HM/體質(zhì)量(body mass，BM)]。

2.2.4 心肌病理組織學(xué)變化每組隨機(jī)選擇3只大鼠，取心臟，浸入40 ng·L-1多聚甲醛溶液中，24 h 后按常規(guī)方法進(jìn)行脫水，脫水處理后用石蠟包埋，切片(厚度約5 μm)；放置于二甲苯溶液中浸泡10 min，取出，再次更換二甲苯浸泡 10 min，取出，放置于50%二甲苯浸泡5 min，將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色數(shù)分鐘，酸水及氨水中分色10 s，流水沖洗1 h后入蒸餾水片刻，70%和90%乙醇中脫水各10 min，入伊紅染色液染色 2 min，經(jīng)100%乙醇脫水，再經(jīng)二甲苯使切片透明，并鏡檢拍照。

2.2.5 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的檢測將上述HE染色的蠟塊，采用TUNEL法按照試劑盒說明書執(zhí)行各項操作。切片滴加20 ng·L-1蛋白酶K，20 min后，用PBS(pH7.4)洗3次，每次5 min，加3%小牛血清白蛋白和20%小牛血清，15 min后，滴加反應(yīng)液 50 μL，置濕盒內(nèi)，37 ℃放置1 h，加0.01 mol·L-10.3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，采用PBS(pH7.4)洗3次，每次5min，加3%小牛血清白蛋白、1%封阻劑和20%小牛血清孵育15 min，滴加 12稀釋的POD(HRP連結(jié)的抗熒光素抗體) 20 μL孵育30 min，采用PBS(pH 7.4)洗3次，每次 5 min，鏡檢細(xì)胞核棕褐色即為陽性，每個標(biāo)本鏡檢5張切片，AI=凋亡細(xì)胞核/總細(xì)胞核數(shù)。

2.2.6 心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測ROS檢測：①將大鼠(假手術(shù)組、模型組、卡托普利組、麝香保心丸低劑量組、麝香保心丸中劑量組、麝香保心丸高劑量組，每組8只)部分心肌組織剪碎，并用PBS漂洗。之后加入消化酶，在37 ℃恒溫水浴鍋中水浴加熱 20 min，300目過篩，離心(離心半徑8 cm，3 000 r·min-1，5 min)，PBS漂洗2次，制備單細(xì)胞懸液，加入DCFH-DA稀釋液(100 μL，1500)，37 ℃ 孵育 1 h，PBS漂洗；通過化學(xué)熒光法檢測ROS。②MDA、SOD、GSH-Px檢測：取上述各組大鼠部分心肌細(xì)胞剪碎，加入PMSF混合液與Lysis buffer(800 μL)，離心(離心半徑8 cm，12 000 r·min-1，10 min，4 ℃)，取上清液BCA定量，并通過Excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白濃度，MDA、SOD、GSH-Px檢測步驟參考試劑盒說明書。

2.2.7 Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因水平的檢測每組隨機(jī)選擇3只大鼠，取心臟，通過Trizol法提取RNA，沉降、洗滌、重懸后反轉(zhuǎn)錄cDNA，采用紫外分光光度計檢測RNA含量。擴(kuò)增體系20 μL，預(yù)變性95 ℃30 s，變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 34 s，延伸95 ℃ 15 s，循環(huán)40次。LRP6引物：上游5′-CGTCTACTGGACGGACGATG-3′，下游5′-GGTCCCATTGAGCCTTGTCA-3′，長度187 bp；GSK-3β上游 5′-GGGACAGTGGTGTGGATCA-3′，下游5′-GCCGAAAGACCTTCGTCCAA-3′，長度144 bp；3β-catenin上游5′-ATCATTCTGGCCAGTGGTGG-3′，下游5′-GACAGCACCTTCAGCACTCT-3′，長度104 bp。每個樣本3個復(fù)孔，并通過2-△△CT法計算其表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 大鼠心臟超聲心動圖的測定與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVDs、LVDd、LVESV、LVEDV均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，麝香保心丸組低、中、高劑量組及卡托普利組大鼠LVDs、LVDd、LVESV、LVEDV均明顯下降(P<0.05，P<0.01)。見表1、圖1。

表1 各組大鼠心臟超聲心動圖結(jié)果比較

注：假手術(shù)組；B：模型組；C：卡托普利組；D：麝香保心丸低劑量組；E：麝香保心丸中劑量組；F：麝香保心丸高劑量組圖1 各組大鼠心臟超聲心動圖

3.2 大鼠血漿BNP水平的測定與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血漿BNP水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，麝香保心丸低、中、高劑量組及卡托普利組大鼠血漿BNP水平顯著下降(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠血漿BNP水平比較

3.3 大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)的測定與假手術(shù)組比較，模型組大鼠HWI、LVMI均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，麝香保心丸低、中、高劑量組及卡托普利組大鼠HWI、LVMI均顯著下降(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)比較

3.4 大鼠心肌細(xì)胞HE染色及心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的測定假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊、結(jié)構(gòu)規(guī)則，心肌纖維完整，未出現(xiàn)變形壞死；模型組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂、形態(tài)各異，部分心肌纖維變形；麝香保心丸低、中、高劑量組及卡托普利組大鼠心肌細(xì)胞受損程度明顯低于模型組，心肌細(xì)胞排列較為整齊。見圖2。

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞AI顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，麝香保心丸低、中、高劑量組及卡托普利組大鼠心肌細(xì)胞AI顯著下降(P<0.01)。見圖3、表4。

表4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

注：假手術(shù)組；B：模型組；C：卡托普利組；D：麝香保心丸低劑量組；E：麝香保心丸中劑量組；F：麝香保心丸高劑量組圖2 大鼠心肌細(xì)胞病理學(xué)結(jié)果(HE，×200)

注：假手術(shù)組；B：模型組；C：卡托普利組；D：麝香保心丸低劑量組；E：麝香保心丸中劑量組；F：麝香保心丸高劑量組圖3 大鼠心肌細(xì)胞凋亡(×200)

3.5 大鼠心肌組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的測定與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織ROS、MDA水平顯著升高(P<0.01)，SOD、GSH-Px水平顯著下降(P<0.01)；與模型組比較，麝香保心丸低、中、高劑量組及卡托普利組大鼠心肌組織ROS、MDA水平均顯著降低(P<0.01)，SOD、GSH-Px水平均顯著升高(P<0.01)。見圖4、表5。

表5 各組大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

3.6 對大鼠心肌組織LRP6mRNA、GSK-3βmRNA、3β-cateninmRNA水平的影響與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織LRP6mRNA、GSK-3βmRNA、3β-cateninmRNA水平均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，麝香保心丸低、中、高劑量組及卡托普利組大鼠心肌組織LRP6mRNA、GSK-3βmRNA、3β-cateninmRNA水平均顯著降低(P<0.01)。見表6。

表6 對大鼠LRP6 mRNA、GSK-3β mRNA、3β-catenin mRNA水平的影響

注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：卡托普利組；D：麝香保心丸低劑量組；E：麝香保心丸中劑量組；F：麝香保心丸高劑量組圖4 大鼠心肌細(xì)胞ROS流式圖

4 討論

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病心力衰竭是臨床常見的心血管疾病，患者的心輸出量下降導(dǎo)致機(jī)體靜脈回流不暢[10-12]。在心力衰竭疾病進(jìn)程中，心肌結(jié)構(gòu)的改變是導(dǎo)致疾病惡化的關(guān)鍵因素。抑制、緩解心室重構(gòu)是治療心力衰竭的關(guān)鍵所在[13-14]。中醫(yī)藥在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病心力衰竭中運(yùn)用較為廣泛，麝香保心丸是由《太平惠民和劑局方》中的蘇合香丸衍生而來的中成藥，在臨床中應(yīng)用十分廣泛，主要用于治療心功能不全、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等心腦血管疾病[15]。研究發(fā)現(xiàn)，麝香保心丸具有改善心肌重構(gòu)、擴(kuò)張冠狀動脈、減輕心肌纖維化、改善冠狀動脈血管痙攣、促進(jìn)缺血心肌局部微循環(huán)、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等[16]。

心臟等重要靶器官缺氧缺血會造成能量代謝紊亂，機(jī)體可通過中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)、產(chǎn)生黃嘌呤氧化酶的途徑產(chǎn)生大量氧自由基[17-18]。機(jī)體抗氧化能力下降，導(dǎo)致心肌細(xì)胞等長期處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。自由基會加重對心臟的損傷并促進(jìn)心肌纖維化進(jìn)程，引發(fā)心室重構(gòu)，進(jìn)一步加重心功能障礙，發(fā)展為心力衰竭。有研究指出，β-catenin敲除可抑制心肌、細(xì)胞分化、防止心室重構(gòu)，有利于改善心力衰竭患者的預(yù)后[19]。此外，Wnt也是驅(qū)動組織形態(tài)與結(jié)構(gòu)變化的關(guān)鍵因素。提示心室重構(gòu)與Wnt/β-catenin通路有密切關(guān)聯(lián)[20]。研究表明，Wnt/β-catenin通路與線粒體力學(xué)間關(guān)系密切，LRP6作為其中的關(guān)鍵紐帶，可激活分裂蛋白Drp1造成線粒體功能障礙，導(dǎo)致心功能不全、致死性擴(kuò)張型心肌病等[21-22]。GSK-3β可作用于眾多轉(zhuǎn)錄因子與信號蛋白結(jié)構(gòu)蛋白，在細(xì)胞中過度活化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[23-24]。

本研究表明，麝香保心丸組可顯著降低大鼠血漿BNP水平。BNP是重要的神經(jīng)激素，可反映心室擴(kuò)張程度，BNP水平上升可增加心排出量以維持血容量的穩(wěn)定，加重心力衰竭程度[25-26]。LVDs、LVDd、LVESV、LVEDV可有效反映大鼠的心臟結(jié)構(gòu)，是判斷大鼠心室重構(gòu)程度的有效觀察指標(biāo)，結(jié)合心臟質(zhì)量指數(shù)、超聲心動圖及心肌組織病理學(xué)檢查結(jié)果可知，麝香保心丸可有效抑制心室重構(gòu)、減輕大鼠心肌纖維化程度、抑制心肌細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致心力衰竭進(jìn)一步惡化的關(guān)鍵因素，其發(fā)生機(jī)制可能與氧化應(yīng)激、線粒體損傷有關(guān)[27-28]。當(dāng)心肌細(xì)胞缺氧缺血之后，氧化應(yīng)激水平能力明顯降低，導(dǎo)致ROS大量堆積，不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)過氧化物，中間產(chǎn)物MDA水平升高，機(jī)體氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)擴(kuò)散與心肌損傷。SOD與GSH-Px能夠?qū)⒆杂苫D(zhuǎn)變?yōu)闊o毒物質(zhì)，減輕機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)[29-30]。本研究發(fā)現(xiàn)，麝香保心丸可顯著減輕大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)心肌細(xì)胞組織。同時，也可降低心肌組織LRP6mRNA、GSK-3βmRNA、3β-cateninmRNA水平，從而抑制心肌重構(gòu)、減少細(xì)胞凋亡、保護(hù)線粒體功能。麝香保心丸在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病心力衰竭大鼠的治療不亞于卡托普利片的治療效果。

綜上所述，麝香保心丸可有效緩解冠狀動脈粥樣硬化性心臟病心力衰竭大鼠心室重構(gòu)進(jìn)程，減輕心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善大鼠心功能，可能通過抑制Wnt/β-catenin通路有關(guān)，其治療效果顯著，值得進(jìn)行推廣應(yīng)用。