葉韜，李成文，高加勝，張海峰，李志堅(jiān)

(九江市第一人民醫(yī)院，江西 九江 332000)

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)中最為常見的惡性腫瘤之一。美國(guó)2018年估計(jì)新發(fā)164 690 例，死亡294 301 例[1]。我國(guó)男性前列腺癌發(fā)病率雖然較歐美國(guó)家低，但是由于人口老齡化、生活方式與飲食結(jié)構(gòu)改變等原因，近年來呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)[2]。研究[3]表明雄激素受體(AR)會(huì)促進(jìn)前列腺癌的進(jìn)展，AR的表達(dá)受DNA甲基化、蛋白泛素化以及MicroRNA(miRNA)等影響。MicroRNA是一類長(zhǎng)度為19～24個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，具有發(fā)夾樣莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，可參與調(diào)控mRNA的表達(dá)，多種重要的生物學(xué)過程(包括細(xì)胞增殖、凋亡、發(fā)育、分化和代謝)與miRNA密切相關(guān)[4]。最近研究[5-7]表明miR-506在結(jié)直腸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、骨肉瘤等進(jìn)展中扮演重要角色。本研究擬通過轉(zhuǎn)染miR-506 mimic觀察前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移能力的變化，進(jìn)一步研究miR-506在前列腺癌中的作用，為前列腺癌提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞

人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP，C4-2，22Rv1，PC-3及Du145細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器

胰蛋白酶(Gibco公司，貨號(hào)25200056)，二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司，貨號(hào)D2650)，Lipofectamine TM 2000試劑(賽默飛公司，貨號(hào)11668019)，DEPC水(Invitrogen公司，貨號(hào)AM9906)，Trizol試劑(天根生化科技有限公司，貨號(hào)15596026)，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(賽默飛公司，貨號(hào)12574018)，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(Thermo公司，貨號(hào)69385)，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore公司，貨號(hào)88520)，鼠抗AR(Abcam公司，貨號(hào)ab133273)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體(Abcam公司，ab181602)，胎牛血清(Sigma公司，貨號(hào)1270548)，RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司，貨號(hào)22400105)。miR-506 mimic及陰性對(duì)照均購(gòu)于廣州市銳博生物科技有限公司(貨號(hào)miR10002878-1-5)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

前列腺癌細(xì)胞系LNCaP，C4-2，22Rv1，PC-3及Du145細(xì)胞均在10%胎牛血清的高糖RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine 2000試劑說明書進(jìn)行。

1.2.2 細(xì)胞miRNA提取和miR-506的定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)

細(xì)胞miRNA提取按照mirVana miRNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。以miRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，并用SYBR Green法進(jìn)行定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，檢測(cè)miR-506和內(nèi)參照U6的水平。逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR按照試劑盒說明書進(jìn)行。引物序列如下。miR-506上游：TGCGGTAAGGCACCCTTCTGAGTAG，下游：CCAGTGCAGGGTCCGAGGT；U6上游：TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC，下游：CCAGTGCAGGGTCCGAGGT。miR-506的相對(duì)表達(dá)水平用2-ΔCt表示，其中ΔCt=CtmiR-506-CtU6。將細(xì)胞對(duì)照組的miR-506表達(dá)水平設(shè)為1，計(jì)算其他各組miR-506的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3 MTT試驗(yàn)

將細(xì)胞按照每孔5×104接種于96孔板，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)一定時(shí)間后，每孔細(xì)胞加入DMSO試劑150 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，采用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在490 nm波長(zhǎng)時(shí)的吸光度值，以各組平均值評(píng)估細(xì)胞活性。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞接種到24孔板的3個(gè)孔中(每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔)，貼壁后用無(wú)菌的200 μL槍頭垂直劃痕，磷酸鹽平衡生理鹽水(PBS)清洗脫壁的細(xì)胞。劃痕48 h后在顯微鏡下拍照并測(cè)量寬度。

1.2.5 遷移實(shí)驗(yàn)

將Transwell小室放入加有750 μL的10% FBS的培養(yǎng)基24孔板中，向小室中加入200 μL的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)48 h后取出上室，吸除培養(yǎng)基，PBS清洗兩次，用棉簽輕柔拭去上室里面的細(xì)胞，無(wú)水甲醇固定15 min，取出小室翻轉(zhuǎn)晾干10 min，0.1%的結(jié)晶紫染色20 min，PBS清洗兩次，將小室放于24孔板里，置于倒置顯微鏡下照相，隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 miR-506在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)(qPCR)檢測(cè)miR-506在前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)，結(jié)果顯示：與LNCaP(0.445±0.053)細(xì)胞相比，C4-2，22Rv1，PC-3及Du145的miR-506表達(dá)均顯著降低[(0.31±0.02)，(0.42±0.01)，(0.25±0.01)，(0.23±0.01)]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

2.2 AR在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

同樣應(yīng)用qPCR檢測(cè)AR在前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)，結(jié)果顯示：與LNCaP(0.445±0.053)細(xì)胞相比，C4-2和22Rv1的AR表達(dá)較多[(1.45±0.04)，(1.35±0.04)]，而PC-3及Du145細(xì)胞表達(dá)極少量的AR[(0.02±0.01)，(0.04±0.02)]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

2.3 miR-506對(duì)細(xì)胞AR表達(dá)的影響

由于miR-506在C4-2細(xì)胞中表達(dá)較低，而AR表達(dá)較高，所以將miR-506 mimic轉(zhuǎn)入C4-2檢測(cè)AR的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，AR的mRNA水平及蛋白表達(dá)均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖1)。

圖1 C4-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-506 mimic 后AR蛋白的表達(dá)

2.4 miR-506對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響

MTT實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)染miR-506 mimic后，C4-2細(xì)胞的增殖能力降低，在72 h(3 d)時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見圖2)。

圖2 C4-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-506 mimic 后細(xì)胞增殖能力比較

2.5 miR-506對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)表明過表達(dá)miR-506后，劃痕48 h時(shí)劃痕的愈合速度明顯低于對(duì)照組(見圖3)。遷移實(shí)驗(yàn)表明過表達(dá)miR-506后顯著降低了C4-2遷移細(xì)胞數(shù)[(77±10) 個(gè)和(45±9)個(gè)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 C4-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-506 mimic 后細(xì)胞愈合能力比較

3 討 論

MicroRNA在腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，可以通過調(diào)控CpG甲基化等影響一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路，改變正常細(xì)胞生理，使其產(chǎn)生癌變，可能涉及細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、血管生成等過程[8]。文獻(xiàn)報(bào)道[9]，至少160余種miRNA與前列腺癌進(jìn)展相關(guān)，其中128種在腫瘤中表達(dá)增加(如miR-153，miR-92a，miR-182等)，38種表達(dá)下調(diào)(如miR-29a，miR-10a，miR-221等)。雄激素及其受體在前列腺癌中的具有重要作用。相對(duì)于PI3K/Akt，mTOR，BCL2等信號(hào)改變，miRNA對(duì)于AR的調(diào)控備受關(guān)注。研究[10]發(fā)現(xiàn)miR-34a，miR-135b，miR-185，miR-421，miR-449，miR-634，miR-9，miR-297等miRNA可與AR的3′-UTR結(jié)合，抑制其表達(dá)，我們通過在線預(yù)測(cè)軟件(http：//www.targetscan.org)預(yù)測(cè)可能調(diào)控AR的miRNA，進(jìn)一步結(jié)合文獻(xiàn)篩選出本研究對(duì)象miR-506。

miR-506已被證實(shí)與多種癌癥的發(fā)生有關(guān)。在肝癌細(xì)胞中，miR-506靶向作用于鞘氨醇激酶1(SPHK1) mRNA的3′-UTR區(qū)域，抑制SPHK1蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞懸浮液中1-磷酸鞘氨醇(S1P)減少，從而抑制肝癌的血管生成[11]。在胃癌中，長(zhǎng)鏈非編碼RNA NEAT1對(duì)腫瘤進(jìn)展有促進(jìn)作用，聯(lián)合生物信息學(xué)、熒光素酶基因報(bào)告試驗(yàn)、RNA pull down等方法研究發(fā)現(xiàn)，miR-506可與NEAT1結(jié)合，且二者之間存在負(fù)向作用；此外，miR-506還可抑制STAT3 mRNA的表達(dá)，限制胃癌的進(jìn)展，而miR-506抑制劑則可逆轉(zhuǎn)其作用[12]。在卵巢癌中，miR-506抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)錄因子SNAI2表達(dá)，后者抑制E-cadherin的表達(dá)，因而研究發(fā)現(xiàn)miR-506與E-cadherin的表達(dá)呈正相關(guān)，與N-cadherin及vimentin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[13]。在乳腺癌中，miR-506在腫瘤組織中的表達(dá)較正常組織及良性組織下調(diào)，因而推測(cè)miR-506可能參與乳腺癌的病理過程，發(fā)揮類似抑癌基因的作用[14]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)前列腺癌細(xì)胞過表達(dá)miR-506，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力降低，遷移能力削弱，AR的RNA及蛋白表達(dá)受到抑制。提示miR-506可能通過抑制AR的表達(dá)抑制前列腺癌的進(jìn)展。

MicroRNA對(duì)腫瘤的作用機(jī)制多種多樣，依據(jù)其對(duì)腫瘤的作用，可以分為促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的Oncogenic miRNA和抑制腫瘤進(jìn)展的miRNA[15]。無(wú)論是促癌還是抑癌的miRNA，均可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白、mTOR、PI3K信號(hào)調(diào)控細(xì)胞增殖，亦可通過調(diào)節(jié)TGF-β等信號(hào)調(diào)控細(xì)胞侵襲能力[8]。雖然miR-506在腫瘤細(xì)胞中的作用已有諸多報(bào)道[16-17]，但是其在前列腺癌中的作用尚未見報(bào)道。本研究明確miR-506對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的抑制作用，未來進(jìn)一步探究其可能作用機(jī)制。

前列腺癌的治療無(wú)論是在手術(shù)去勢(shì)還是藥物去勢(shì)時(shí)期都圍繞著AR展開，在激素敏感或雄激素抵抗時(shí)期也依賴于持續(xù)抗雄激素治療[3]。目前對(duì)于激素抵抗的前列腺癌的治療仍無(wú)有效辦法。最近研究[18]表明，miR-99a-3p可通過負(fù)向調(diào)控非染色體結(jié)構(gòu)維護(hù)凝縮蛋白Ⅰ復(fù)合體G亞基(NCAPG)抑制初發(fā)及去勢(shì)，抵抗前列腺癌的進(jìn)展。而細(xì)胞分泌外泌體中包含多種miRNA，如miR-517，miR-204，miR-885，miR-143，miR-335，miR-127等也參與前列腺癌的進(jìn)展[19]。miRNA可能作為前列腺癌的標(biāo)志物，對(duì)疾病的診斷、進(jìn)展、預(yù)后等發(fā)揮作用[20]?？梢灶A(yù)見，針對(duì)個(gè)體化的miRNA測(cè)定及靶向治療可以給患者帶來更好的治療效果[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-506可能對(duì)AR存在負(fù)向調(diào)控作用，其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步明確，推測(cè)可能是通過AR對(duì)前列腺癌發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移等產(chǎn)生更多影響。

綜上所述，miR-506可抑制前列腺癌增殖轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步研究其作用可能為前列腺癌的診斷、治療及預(yù)后帶來新的方法策略。