包淋斌，龔劍明，姚利平

（1.廣昌縣畜牧獸醫(yī)局，江西撫州 344900；2.濂溪區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局）

牛口蹄疫是由口蹄疫病毒屬引起的一種烈性的傳染病，主要特征為口、蹄部出現(xiàn)水皰，該病發(fā)病快、傳染性強、死亡率高，對肉牛養(yǎng)殖危害非常大，嚴重影響肉牛養(yǎng)殖場戶的生產(chǎn)效益[1～3]。口蹄疫病毒為無囊膜的RNA病毒，變異頻率很高，致使流行毒和疫苗毒種間存在抗原差異，當差異到一定程度，會降低疫苗的免疫效果[4～5]。?？谔阋逧LISA試驗法是口蹄疫免疫抗體檢測中最為常用、最廣泛、最便捷的一種，具有簡便、快速、靈敏、載體易于標準化等特點，是當前基層動物疫病預防控制中心實驗室檢測口蹄疫最常用的方法。該方法是利用抗原和抗體相結(jié)原理，將抗體吸附在固相載體表面，通過酶標儀吸光強弱，來鑒定的血清中O型口蹄疫抗體水平，判斷肉牛群體的免疫效果[6～7]。本文旨在通過競爭ELISA法對牛O型口蹄疫抗體進行試驗監(jiān)測,為掌握廣昌縣范圍內(nèi)肉牛養(yǎng)殖場O型口蹄疫免疫效果情況，為科學防控O型口蹄疫提供參考依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試劑盒?？谝卟】贵w檢測試劑盒由深圳真瑞生物科技有限公司提供（含對照組：陰性對照組為沒有抗體試驗用試劑液，陽性對照為有抗體試驗用試劑液）。

1.1.2 血清。用采血管采集全縣6個已注射O型口蹄疫疫苗的肉牛養(yǎng)殖場牛血樣共60份，用2 000r/min離心5min，倒出上清血清，裝于1.5mLPE試管中，放于冰箱冷凍，保存?zhèn)溆?，血清清亮，無溶血。

1.1.3 洗滌液的準備。濃縮洗滌液使用前應恢復至室溫，如有鹽結(jié)晶，搖動使結(jié)晶的巖溶解，然后用蒸餾水或去離子水作10倍稀釋。稀釋好的洗滌液可在4℃存放一周左右。

1.1.4 試驗器材。1mL、100uL移液槍及槍頭,普通離心機、微型振蕩器、燒杯、酶標儀等試驗用器材，并做好滅菌消毒工作。

1.2 試驗方法

試驗設計6個試驗組和陰陽對照組，每個組設置10個重復。

2 試驗步驟

將待檢板條按20uL/孔加入樣本稀釋液和對照組；每孔加酶標記物60uL，輕微震蕩混勻，蓋上封板膜，置37℃溫育45min；小心揭開封板膜，甩掉板孔中的溶液，使用工作濃度洗滌液每孔加250uL，后甩去孔內(nèi)液體，以上步驟重復4～6次，最后在干凈吸水紙上拍干；每孔加顯色液100uL，混勻，蓋上封板膜37℃閉光顯色15min；再次小心揭開封板膜，每孔加終止液50uL，使反應終止，10min內(nèi)在調(diào)試好酶標儀上（酶標儀使用450nm，并630nm作參比波長）測定吸光度OD值。

3 計算方法及結(jié)果判定

3.1 計算方法

PI（阻斷率）=（1-（樣品OD值/陰性OD均值））×100%（陰性OD均值為取10個重復樣平均值）

3.2 試驗成立條件

陰性對照（N）OD值＞0.5，同時陽性對照（P）阻斷率＞45%。

3.3 陰陽性判：

PI（阻斷率）＞45%則判斷為陽性；PI（阻斷率）≤45%則判斷為陰性。液相阻斷ELISA檢測抗體效價與本試劑盒檢測PI值得對應關(guān)系詳見表1。

表1 液相阻斷ELISA檢測抗體效價與本試劑盒檢測PI值得對應關(guān)系

4 試驗注意事項

試劑盒使用前各試劑應平衡至室溫，應將試劑盒各組份放置室溫至少1h以上；使用前應搖勻，使用后放回2℃～8℃；不同品種、不同批號試劑盒的試劑組份不得混用，使用試劑時應防止試劑污染。

顯色液和終止液對皮膚和眼可能有刺激性，使用時應注意防護；TMB（顯色液）不要暴露于強光和避免接觸氧化劑；檢測板拆封后應避免受潮或沾水（未用完的抗原被板加干燥劑放于自封袋中，并盡快置于2℃～8℃）。

所有廢棄物在丟棄之前應合理處理以免污染；嚴格遵守操作說明可以獲得最好的結(jié)果。操作過程中移液、定時和洗滌等的全部過程必須精確；抗原包被板為一次性用品，不得重復使用。

5 試驗結(jié)果

試驗結(jié)果見表2，經(jīng)檢測陰性對照OD均值＞0.5，陽性對照PI（阻斷率）＞45%，符合試驗要求，試驗成立；6個肉牛養(yǎng)殖場血清樣全部檢測為陽性；PI（阻斷率）都高于90%以上，說明牛型O口蹄疫抗體水平很高，免疫效果良好。

表2 試驗檢測6個肉牛養(yǎng)殖場結(jié)果

6 討論

接種疫苗是預防口蹄疫的唯一有效方法。免疫接種口蹄疫疫苗目的是保護易感牛，提高免疫水平，降低口蹄疫感染流行風險，降低養(yǎng)殖成本，提高養(yǎng)殖效益[8]。口蹄疫疫苗接種應根據(jù)當?shù)匾咔檫x擇疫苗種類、劑量與次數(shù)，一般口蹄疫疫苗接種應保證每年2～3次[9]。牛血采樣時間過早或過晚都可影響檢測結(jié)果。初步試驗表明，6個肉牛養(yǎng)殖場牛O型口蹄疫免疫效果良好。但目前檢測樣本量太少，為全面掌握全縣的疫情情況，還需要擴大檢測范圍和加大樣本數(shù)量。