黃蓉，伍興，張嫻，艾洪蓮

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院 & 民族藥學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，武漢 430074)

腫瘤是目前嚴(yán)重威脅人類生命健康的疾病之一，抗腫瘤藥物不計(jì)其數(shù)，其作用機(jī)制也各不相同，其中誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是癌癥藥物治療的有效途徑. 調(diào)控細(xì)胞凋亡的通路主要有3種：線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和激活死亡受體通路. 研究表明，3條凋亡通路相互聯(lián)系，相互調(diào)控，最終都會(huì)通過激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起細(xì)胞凋亡[1-2].

植物內(nèi)生真菌是與植物共生而不引起植物病變和排斥的真菌[3],在與植物共同進(jìn)化的過程中能產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的次生代謝產(chǎn)物. 這些次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)新穎多樣，生物藥理活性豐富, 是藥物篩選的天然寶庫(kù)[4-5].α-丁烯內(nèi)酯是一類廣泛存在于天然產(chǎn)物的活性單元，其衍生物具有抗氧化、抗菌、抗炎和抑制α-葡萄糖苷酶等多種生物活性[6-8]. 在前期研究中，從馬鈴薯內(nèi)生真菌Aspergilluscarneus中分離得到一系列丁烯內(nèi)酯類化合物[9]，其抗腫瘤活性未見報(bào)道. 因此，本文以人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞為研究對(duì)象，用MTT法檢測(cè)這一類化合物抗腫瘤活性，初篩后選取了活性較好的化合物Asperteretal D(圖1)，本文就其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制展開研究.

圖1 化合物Asperteretal D結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of compound Asperteretal D

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7(武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC)；胎牛血清(浙江天杭)，DMEM、胰蛋白酶(美國(guó)Hyclone)；MTT(美國(guó)Sigma)； GAPDH兔多抗(武漢三鷹)、PARP兔多抗、Caspase-9兔多抗、Caspase-3兔多抗、Active Caspase-3兔單抗、P53兔多抗、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(武漢愛博泰克)；HRP-山羊抗兔IgG、BCA蛋白定量試劑盒、BSA、ECL顯色液、Annexin V/FITC-PI試劑盒(上海碧云天)；PVDF膜(美國(guó)Millipore).

CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific)，倒置顯微鏡(日本Nikon)，多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan Spark)，臺(tái)式機(jī)冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf)，凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad)，脫色搖床(北京六一)，高壓滅菌鍋(上海博迅)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶及細(xì)胞孔板(美國(guó)Corning)，，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD)，蛋白電泳轉(zhuǎn)膜裝置(美國(guó)Bio-Rad).

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞活力檢測(cè)

MCF-7細(xì)胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)基，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng). 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×104個(gè)/孔接種到96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)6～7 h后待其貼壁后進(jìn)行分組處理. 使用無血清培養(yǎng)基將化合物Asperteretal D配制成0.25、1、2、5、8和13 μM濃度的工作液. 空白組：加入無血清培養(yǎng)液；給藥組：分別加入不同濃度的Asperteretal D工作液，每孔100 μL，每組3個(gè)復(fù)孔. 孵育24 h后棄掉舊培養(yǎng)基，每孔加入100 μL的0.5 mg/mL的MTT試劑，培養(yǎng)4 h，棄上清，加入100 μL DMSO溶解紫色結(jié)晶，10 min后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在570 nm處的吸光度，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析. 細(xì)胞存活率=給藥組/空白組×100%.

1.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔接種到六孔板中，6～8 h后待細(xì)胞貼壁，棄去舊培養(yǎng)基，加入無血清培養(yǎng)基配制的Asperteretal D溶液，終濃度為0、3.5、7和14 μM. 在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后將細(xì)胞收集至1.5 mL EP管中. 用無菌PBS充分洗滌細(xì)胞沉淀2次，棄去上清后加入195 μL染色結(jié)合液，充分重懸細(xì)胞，雙染樣品中添加5 μL AnnexinV-FITC 染色液和10 μL PI染色液，充分混勻，避光室溫孵育15 min后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè).

1.4 分子對(duì)接

從蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(www.rcsb.org)得到PARP、Caspase-3、Caspase-9、P53、Bcl-2和Bax蛋白的X射線晶體結(jié)構(gòu)，作為分子對(duì)接受體. 通過 Sybyl-X 2.0 制備Asperteretal D的三維結(jié)構(gòu)，利用標(biāo)準(zhǔn)的tripos力場(chǎng)對(duì)Asperteretal D分子進(jìn)行能量最小化，通過標(biāo)準(zhǔn)程序制備蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)，去除結(jié)合配體和水后生成活性位點(diǎn)[10]. 基于對(duì)接模型，對(duì)化合物Asperteretal D進(jìn)行結(jié)合分析，并預(yù)測(cè)對(duì)接分?jǐn)?shù). 采用DS軟件中Receptor-Ligand Interactions模塊對(duì)分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行分析，并制作二維效果圖.

1.5 蛋白免疫印跡法測(cè)定蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔接種到六孔板中6～8 h后待細(xì)胞貼壁，棄去舊的培養(yǎng)基，加入新鮮無血清培養(yǎng)基1 mL，細(xì)胞分組及處理方法同1.3. 待培養(yǎng)結(jié)束后棄上清，用胰酶將細(xì)胞消化收集至1.5 mL的EP管中，用預(yù)冷PBS洗滌3次，使用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液在冰上裂解蛋白. 離心取上清，按照BCA蛋白定量試劑盒的操作說明對(duì)所提取的蛋白進(jìn)行定量. 加入蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min使蛋白變性，采用聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離蛋白，再將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5% BSA在室溫下封閉，1 h后加入一抗，于4 ℃下孵育過夜. TBST緩沖液洗膜，加HRP-山羊抗兔二抗孵育1 h后進(jìn)行ECL顯影. 以GAPDH為內(nèi)標(biāo)，定量分析各組細(xì)胞中蛋白的表達(dá)情況.

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以ˉx±s的形式表示，采用 GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用單因素方差法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物Asperteretal D對(duì)細(xì)胞活力的影響

MCF-7細(xì)胞與不同濃度的化合物Asperteretal D共孵育24 h后，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2. 圖中隨著化合物濃度的升高，細(xì)胞存活率逐漸下降，非線性擬合后計(jì)算出IC50=(6.39±0.21) μM，表明化合物Asperteretal D對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖具有抑制作用，且呈濃度依賴性.

圖2 Asperteretal D對(duì)MCF-7細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effect ofAsperteretal D on the viability of MCF-7 cells

2.2 化合物Asperteretal D對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用

流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)表明(圖3)，隨著化合物濃度的升高，MCF-7細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡總比例逐步增加，凋亡率從12.26%(空白組)升至14.03%、19.12%和37.2%，7 μM和14 μM Asperteretal D均能顯著地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(P<0.01).

圖3 Asperteretal D對(duì)MCF-7不同階段凋亡的影響Fig.3 Effect of Asperteretal D on apoptosis of MCF-7 at different stages

2.3 化合物Asperteretal D與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的分子對(duì)接

為研究化合物Asperteretal D與凋亡相關(guān)蛋白的作用方式，通過分子對(duì)接模擬計(jì)算其結(jié)合模式，對(duì)接結(jié)果以反映蛋白與配體親和力大小的Total Score呈現(xiàn)(表1)，Total Score是評(píng)價(jià)小分子配體與蛋白受體結(jié)合強(qiáng)弱的標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)分越高表示配體與受體的親和能力越好(total-score≥7.5)[11]. Bcl-2家族蛋白主要存在于細(xì)胞的線粒體外膜，是細(xì)胞凋亡重要調(diào)節(jié)因子，主要有促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2，兩者相互作用共同調(diào)控細(xì)胞因子從線粒體中釋放[12]. 計(jì)算結(jié)果顯示，化合物Asperteretal D能夠有效與Caspase家族蛋白、Bcl家族蛋白和P53蛋白結(jié)合，從而激活腫瘤細(xì)胞凋亡通路(圖4).

表1 Asperteretal D與不同蛋白分子對(duì)接結(jié)果評(píng)分

圖4 Asperteretal D與蛋白分子對(duì)接二維圖Fig.4 Two-dimensional diagram of docking between Asperteretal D and proteins

2.4 化合物Asperteretal D對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

由圖5可知，MCF-7細(xì)胞與14 μM化合物Asperteretal D孵育24 h后，胞內(nèi)的pro Caspase-9、pro Caspase-3和PARP-1蛋白表達(dá)量均顯著減少(P<0.05)，表明Asperteretal D啟動(dòng)了細(xì)胞內(nèi)的Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使得Caspase-9發(fā)生自我剪切，隨即活化凋亡執(zhí)行者Caspase-3，切割靶蛋白底物PARP-1，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡. 當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激后產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，線粒體膜通透性改變，細(xì)胞色素C釋放到胞質(zhì)中[13]，與Apfa-1、pro Caspase-9結(jié)合形成凋亡小體[14]，并進(jìn)一步活化下游的凋亡執(zhí)行者Caspase-3[15]，剪切包括PARP-1、DNA-PK、U1-70 kD在內(nèi)的多種凋亡相關(guān)蛋白. 多聚ADP核糖聚合酶-1(PARP-1)是一種多功能的蛋白質(zhì)翻譯后修飾酶, 在DNA突變損傷修復(fù)以及維持基因組穩(wěn)定性中起著至關(guān)重要的作用[16]. 當(dāng)PARP-1被Caspase-3剪切后喪失基因修復(fù)能力, 細(xì)胞活性受到抑制而凋亡.

P53是乳腺癌中最常見的突變基因, 其編碼的P53蛋白參與調(diào)控細(xì)胞周期和DNA修復(fù)，可通過線粒體通路和死亡受體途徑干擾Caspase信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17-18]. 圖5顯示,化合物Asperteretal D能顯著上調(diào)P53蛋白的表達(dá).

圖5 Asperteretal D對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響Fig.5 Effect of Asperteretal D on the expressions of apoptosis-related proteins

3 結(jié)語(yǔ)

馬鈴薯內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物丁烯內(nèi)酯類化合物Asperteretal D能有效抑制MCF-7細(xì)胞的增殖，通過激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)并調(diào)控P53蛋白的表達(dá)，引起腫瘤細(xì)胞凋亡. 不過，雖然分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)?zāi)M了化合物Asperteretal D與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的結(jié)合模式，但其關(guān)鍵作用靶點(diǎn)還有待進(jìn)一步明確.