孫 雷，葉 妮，王亦琳，尹 暉，翟南南，王鶴佳*，徐士新

(1. 中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2. Sciex公司，北京 100016)

克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇等β-受體激動(dòng)劑是一類化學(xué)合成的苯乙醇胺類物質(zhì)，人們食用了這些藥物殘留的動(dòng)物性食品后會(huì)出現(xiàn)面色潮紅、頭痛、頭暈、胸悶、心悸、四肢麻木等不良反應(yīng)癥狀，嚴(yán)重的可能危及生命。因此，包括我國(guó)在內(nèi)的很多國(guó)家先后立法禁止該類藥物的使用。

目前，β-受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè)方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法[1-4]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5-12]以及免疫分析法[13-14]等。與其他方法相比，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法不用衍生化反應(yīng)，可以有效的降低干擾，大幅度的提高選擇性，從而為檢測(cè)方法提供了極低的基線、極優(yōu)的定量限和良好的線性。但像豬肝臟等基質(zhì)復(fù)雜動(dòng)物性食品，當(dāng)藥物含量較低時(shí)，使用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)傳統(tǒng)的MRM采集模式有時(shí)并不能消除來自本底噪音或者其它物質(zhì)的干擾，就會(huì)導(dǎo)致較高的基線、較差的定量限和重現(xiàn)性，檢測(cè)結(jié)果存在假陽(yáng)性或假陰性的風(fēng)險(xiǎn)。在這種情況下，增加一級(jí)質(zhì)譜即第三級(jí)質(zhì)譜(MS/MS/MS，或MS3)，采用MRM3采集模式，可以更有效的消除基質(zhì)干擾，降低本底基線，進(jìn)一步提高方法的選擇性，為檢測(cè)工作提供更準(zhǔn)確可靠的技術(shù)支持。

基于高選擇性的MRM3液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)建立豬肝臟等復(fù)雜動(dòng)物性食品中克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇?xì)埩魴z測(cè)的新方法，使方法穩(wěn)定性好，選擇性強(qiáng)，靈敏度高，為提高β-受體激動(dòng)劑類藥物的殘留監(jiān)控能力，保障動(dòng)物性食品質(zhì)量安全提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器 液相色譜-三重四極桿/線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜儀(Qtrap 6500，美國(guó)SCIEX公司)；漩渦混合器(SIR4，廣州IKA公司)；電熱恒溫振蕩水槽(DKZ-2型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司)； pH計(jì)(Delta 320，Mettler Toledo儀器(上海)有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(Biofuge Strators，德國(guó)賀利氏公司)；氮吹儀(Organomation Associates，美國(guó)Jnc公司)；超純水機(jī)(Milli-Q，美國(guó)Millipore公司)。

1.2 材料、藥品與試劑 克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇(純度均大于98.0%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司)；乙酸乙酯、叔丁基甲醚和甲酸(色譜純，美國(guó)Fisher公司)；MCX固相萃取柱(60 mg/3 mL，美國(guó) Waters公司)；微孔濾膜(0.22 μm，美國(guó)Pall公司)；所用水為超純水。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱定適量的克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并配制成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃下保存。準(zhǔn)確吸取0.1 mL克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，于-20 ℃下保存。

1.4 色譜條件 色譜柱：Phenomenex F5(50 mm×3.0 mm，2.6 μm)；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相A：0.1%甲酸溶液；流動(dòng)相B：0.1%甲酸乙腈溶液；進(jìn)樣量：5 μL；流速：0.5 mL/min。梯度洗脫程序：0～0.5 min保持5%B；0.5～5 min，5%B線性變化到60%B，5～6 min，保持95%B，6～7.5 min保持5%B。

1.5 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源正離子模式；掃描方式：三級(jí)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM3)模式；離子化電壓(IS)：5500V；源溫(TEM)：550 ℃；氣簾氣(CUR)：30 psi；碰撞氣(CAD)：Medium；霧化氣(GS1)：50 psi；輔助氣(GS2)：60 psi。MRM3監(jiān)測(cè)離子對(duì)及質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇MRM3監(jiān)測(cè) 離子對(duì)、去簇電壓、碰撞能量和激發(fā)能量Tab 1 Monitoring ion pairs, declustering potentials (DP)、collison energies(CE) and excitation energy(AF2) of clenbuterol、ractopamine and salbutamol

1.6 樣品處理方法 準(zhǔn)確稱取2(±0.02)g待測(cè)樣品于50 mL離心管內(nèi)，加入0.2 mol/L乙酸銨緩沖溶液(pH=5.2)8 mL，再加入β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶40 μL，渦旋混勻，37 ℃下避光水浴振蕩16 h。酶解后放置至室溫，渦旋混勻，10 000 r/min離心10 min，傾出上清液于另一50 mL離心管內(nèi)，用10 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至10±0.5。加入乙酸乙酯15 mL，中速振蕩10 min，5 000 r/min離心5 min，取上層有機(jī)相至另一50 mL離心管內(nèi)。下層水相中再加入叔丁基甲醚10 mL，中速振蕩10 min，5 000 r/min離心5 min，取上層有機(jī)相，合并于乙酸乙酯萃取液中，50 ℃下氮?dú)獯蹈?，?%甲酸溶液5 mL溶解，備用。MCX固相萃取柱依次用甲醇、2%甲酸水溶液各3 mL活化，取備用液全部過柱，依次用2%甲酸水溶液、甲醇各3 mL淋洗，抽干，用5%氨化甲醇溶液3 mL洗脫。洗脫液50 ℃下氮?dú)獯蹈?，殘余物中加?0%甲醇溶液(含0.1%甲酸)0.5 mL，充分溶解，過0.22 μm濾膜后供上機(jī)測(cè)定，采用基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 三級(jí)質(zhì)譜MRM3采集離子對(duì)結(jié)果 使用50%甲醇溶液作為溶劑，配制100 ng/mL的克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用針泵恒流進(jìn)樣的方式，進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化。在正離子全掃描模式下先進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描(MS1)獲得母離子信息。然后，設(shè)定一定的碰撞能量，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜子離子掃描(MS2)，獲得一個(gè)二級(jí)子離子信息。最后，設(shè)定一定的激發(fā)能量，進(jìn)行三級(jí)離子阱質(zhì)譜孫離子掃描(MS3)，獲得兩個(gè)三級(jí)孫離子信息。最終選定的離子對(duì)分別為克侖特羅277.0>203.0>132.1和277.0>203.0>168.0、萊克多巴胺302.1>284.1>121.1和302.1>284.1>164.2、沙丁胺醇240.3>222.2>148.1和240.3>222.2>166.1。根據(jù)歐盟2002/657/EC規(guī)定的一個(gè)母離子1個(gè)IP，一個(gè)子離子及一個(gè)孫離子各1.5個(gè)IP，可以得出每種藥物各5.5個(gè)IP，遠(yuǎn)超過規(guī)定的禁用藥物4個(gè)IP要求，很好的滿足了法規(guī)對(duì)于禁用藥物的規(guī)定。三種藥物的MRM3典型質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的MRM3質(zhì)譜圖Fig 1 MRM3 mass spectrum of clenbuterol、ractopamine and salbutamol

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 方法線性 添加適量克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇混合標(biāo)準(zhǔn)工作液于空白豬肝臟組織中，制得濃度為0.5、1、2、5、10 μg/kg的系列基質(zhì)添加樣品，經(jīng)前處理后依次上機(jī)測(cè)定。以基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，各藥物定量離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(表2)。可以看出三種藥物在0.5～10 μg/kg的系列濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99。

2.2.2 方法靈敏度和精確度 采用空白添加目標(biāo)化合物的方法，依據(jù)特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比S/N>10為方法定量限，得出三種藥物在豬肝臟組織中的定量限均為0.5 μg/kg。0.5 μg/kg空白豬肝臟添加樣品，經(jīng)前處理后獲得的克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇三級(jí)質(zhì)譜特征離子質(zhì)量色譜圖見圖2。

圖2 克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇三級(jí)質(zhì)譜特征離子質(zhì)量色譜圖Fig 2 MRM3 chromatograms of clenbuterol、ractopamine and salbutamol

添加0.5、2和10 μg/kg三個(gè)濃度水平的藥物，進(jìn)行方法回收率和精密度考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的回收率范圍在89.7%-102.1%，批內(nèi)批間RSD均小于20%(表3)。

表2 三種藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)Tab 2 Calibration curves and correlation coefficients of three drugs in pig liver

3 討論與結(jié)論

3.1 樣品前處理方法 β-受體激動(dòng)劑在動(dòng)物體內(nèi)代謝過程中，在葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶、硫酸酯等作用下發(fā)生各種軛合反應(yīng)，生成各種軛合物長(zhǎng)期存在，因此在樣品提取前要進(jìn)行酶解，使其結(jié)合態(tài)的待測(cè)物解離釋放出來。有關(guān)酶解的方法、酶的品種、酶用量、酶解時(shí)間均有人做過研究，本方法直接參考了這些研究報(bào)道[5,10-11]。為了提取酸性水溶液中成鹽的β-受體激動(dòng)劑，先用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至堿性，使藥物呈游離狀態(tài)，然后為兼顧不同性質(zhì)的β-受體激動(dòng)劑，本方法參考已有文獻(xiàn)，選擇了疏水性的乙酸乙酯和叔丁基甲醚從水相中萃取藥物的方法[5]。豬肝樣品中含有大量的復(fù)雜基質(zhì)，嚴(yán)重干擾殘留測(cè)定，本方法參考已有報(bào)道，選用混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱(MCX)作為凈化柱，起到了較好的凈化效果[8-12]。

表3 空白豬肝臟中三種藥物添加回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)Tab 3 Average recoveries and precisions(RSD) of three drugs in spiked blank pig liver (n=5)

3.2 三級(jí)質(zhì)譜MRM3模式檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn) 在日常檢測(cè)過程中，對(duì)于豬肝臟等基質(zhì)復(fù)雜動(dòng)物性食品，當(dāng)檢測(cè)β-受體激動(dòng)劑等禁用藥物在含量較低的情況下，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)色譜峰的干擾，給方法的準(zhǔn)確定性定量帶來困擾，采用三級(jí)質(zhì)譜的MRM3模式可以有效的去除本底或基質(zhì)帶來的干擾，使目標(biāo)化合物的測(cè)定具有更高的選擇性。例如，對(duì)豬肝臟空白樣品采用傳統(tǒng)的MRM模式檢測(cè)時(shí)，有時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)有共流出物質(zhì)干擾目標(biāo)物克侖特羅的測(cè)定(圖3左)，從而造成假陽(yáng)性結(jié)果，在使用MRM3模式后，因?yàn)槿?jí)質(zhì)譜MRM3的高選擇性，完全消除了空白樣品中共流出物的干擾，得到毫無(wú)干擾的空白樣品色譜圖(圖3中)及空白添加樣品色譜圖(圖3右)。

圖3 空白豬肝臟MRM和MRM3色譜圖及空白添加樣品MRM3色譜圖Fig 3 MRM and MRM3 chromatograms of blank pig liver and MRM3 chromatograms of blank pig liver spiked

研究建立了高選擇性MRM3液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)豬肝臟等復(fù)雜動(dòng)物性食品中克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇?xì)埩魴z測(cè)的新方法。該方法采用三級(jí)質(zhì)譜MRM3模式通過對(duì)母離子、子離子和孫離子三級(jí)離子的監(jiān)測(cè)，使方法的選擇性更強(qiáng)，靈敏度更高，回收率和精密度等技術(shù)參數(shù)都能滿足獸藥殘留分析方法的要求，為進(jìn)一步提高β-受體激動(dòng)劑類藥物的殘留監(jiān)控能力，保障動(dòng)物性食品質(zhì)量安全提供了技術(shù)支持。