魏秀麗，張傳津*，張 琦，劉霄飛，張志民，楊志昆

(1.山東省飼料獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)中心，濟(jì)南250100；2.山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測與風(fēng)險(xiǎn)評估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南250100)；(3.動物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測與精準(zhǔn)化用藥山東省工程實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南250100；4.山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，濟(jì)南250100)

卡那霉素是一種人醫(yī)臨床使用的藥物，起初用于抗感染的治療[1-2]。獸醫(yī)臨床中，有硫酸卡那霉素注射液、單硫酸卡那霉素可溶性粉或注射用硫酸卡那霉素的劑型，已經(jīng)應(yīng)用多年。從國家獸藥基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫中，可以查到曾經(jīng)有上百個(gè)生產(chǎn)批準(zhǔn)文號，有部分已經(jīng)過期，還有變更換新批準(zhǔn)文號的生產(chǎn)廠家。對假劣獸藥或飼料添加劑的查處，依然是各級主管部門的監(jiān)督重點(diǎn)。

應(yīng)客戶委托檢測一種白色的未知粉末，違法者違規(guī)生產(chǎn)，無任何生產(chǎn)信息的標(biāo)簽可查。未知其主要成分。關(guān)于卡那霉素的檢測方法，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，有蒸發(fā)光散射法(HPLC-ELSD)[1-2]、微生物管碟法[3]、柱后衍生化法[4]、電噴霧法(HPLC-CAD)[5-7]、紫外可見分光光度法[8-10]，質(zhì)譜法[11]等多種方法可以選擇；根據(jù)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件，前期用超高效液相色譜進(jìn)行篩選后，初步懷疑是卡那霉素，后期建立了未知藥品中卡那霉素的測定-超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法，本方法通過優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件，提高了分離效果，可以作為確證方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 分析天平：感量0.00001 g；儀器Waters AcquityTMUltra performance LC超高效液相色譜儀，Waters Quattro premierXE超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜儀，均為Waters公司；0.22 μm的濾膜為Waters 公司。

1.2 藥品及試劑 卡那霉素，批號K0071411，773 U/mg；新霉素，批號K0091511，671 U/mg；安普霉素，批號K0231610，571 U/mg；大觀霉素，批號K0261705，644 U/mg；四種藥物標(biāo)準(zhǔn)品均購買自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；甲酸、乙腈、甲醇均為色譜純；葡萄糖，分析純；超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 超高效液相色譜-二極管陣列檢測法色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)；流動相A：乙腈(0.05%磷酸)；流動相B：水溶液(0.05%磷酸)；流速：0.35 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；柱溫：35 ℃。液相色譜梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序Tab 1 Liquid chromatographic gradient elution procedure

2.2 超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)；流動相A：甲醇(0.1%甲酸)；流動相B：水溶液(0.1%甲酸)；流速：0.35 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL；柱溫：35 ℃。液相色譜梯度洗脫程序見表2。

表2 液相色譜梯度洗脫程序Tab 2 Liquid chromatographic gradient eluent procedure

2.3 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源；正離子掃描(ESI+)；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；離子源溫度：110 ℃；脫溶劑溫度：320 ℃；脫溶劑氮?dú)饬魉伲?50 L/h；毛細(xì)管電壓：2.5 kV；測試藥物定性、定量離子對及對應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量見表3。

表3 定性離子對、定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量Tab 3 Qualitative ion pair, quantitative ion pair, cone hole voltage and collision energy

2.4 樣品制備

2.4.1 陰性樣品 葡萄糖作為陰性樣品。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備 精密稱取卡那霉素等對照品各10 mg，加5%甲醇至25 mL容量瓶中，定容，制成400 μg/mL的溶液，作為外標(biāo)儲備液，-20 ℃冰箱保存。

2.4.3 超高效液相色譜法工作液的制備 精密量取儲備液適量，至10 mL容量瓶中，配置成200 μg/mL的工作液，4 ℃冰箱保存，用于超高效液相色譜的標(biāo)準(zhǔn)工作液使用。

2.4.4 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法工作液的制備 取200 μg/mL的工作液用液相串聯(lián)質(zhì)譜方法中的初始比例流動相適量倍比稀釋10倍，得20 μg/mL的工作液。

2.4.5 標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備 取適量卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液，用空白基質(zhì)溶液稀釋，制備成0.1、0.2、0.5、1、2、5 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取濃度為2 μg/mL的卡那霉素作為UPLC-MS/MS對照品溶液。

2.4.6 陽性添加樣品的制備 精密稱取10 mg卡那霉素加入到陰性樣品190 mg中，充分混勻，配置成的50 mg/g的陽性添加樣品，每次做三份，做三批，共9份平行樣，每份樣品至少進(jìn)樣2次，取平均值。報(bào)告9個(gè)回收率測定結(jié)果并計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

2.5 提取凈化方法

2.5.1 UPLC-PDA供試品 精密稱取空白樣品、待測樣品及陽性添加樣品各100 mg，各置于50 mL容量瓶中，加入5%甲醇定容至50 mL，取濾液作為UPLC-PDA供試品溶液。

2.5.2 UPLC-PDA/MS供試品 取適量母液，用初始流動相水(0.1%甲酸)∶甲醇(0.1%甲酸)=(95∶5)稀釋100倍，用濾膜(0.22 μm)濾過，取濾液作為UPLC-MS/MS供試品溶液。

2.6 方法線性考察及添加回收試驗(yàn)結(jié)果

2.6.1 UPLC-PDA專屬性 在選定的色譜條件下，卡那霉素在2.31 min左右出峰，與未知樣品的保留時(shí)間和光譜圖一致。而安普霉素、新霉素、大觀霉素雖然光譜圖相似，但分別在2.17 min、2.05 min、2.19 min左右出峰。

圖1 卡那霉素色譜圖Fig 1 Kanamycin chromatogram

圖2 卡那霉素光譜圖Fig 2 Spectrogram of Kanamycin

圖3 安普霉素色譜圖Fig 3 Antramycin chromatogram

圖4 安普霉素光譜圖Fig 4 Spectrogram of Ampramycin

圖5 新霉素色譜圖Fig 5 Neomycin chromatography

圖6 新霉素光譜圖 Figure 6 Spectrogram of Neomycin

圖7 大觀霉素色譜圖Fig 7 Spectinomycin chromatography

圖8 大觀霉素光譜圖Fig 8 Spectrogram of spectinomycin

2.6.2 UPLC-MS/MS專屬性 在質(zhì)譜中，卡那霉素在0.54 min左右出峰，保留時(shí)間和兩個(gè)定性離子對都非常一致，未知樣品主成分確證為卡那霉素。陰性樣品、對照品、陽性添加樣品、待測未知樣品的質(zhì)譜圖如下：見圖9-圖12。由于待測樣品的樣品均一度的問題，待測樣品的含量在90～130 mg/g的范圍內(nèi)。

圖9 卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液特征離子質(zhì)量色譜圖Fig 9 Characterized ion mass chromatogram of kanamycin standard solution

圖10 空白樣品特征離子質(zhì)量色譜圖Fig 10 Characteristic ion mass chromatogram of blank sample

圖11 待測樣品特征離子質(zhì)量色譜圖Fig 11 Characteristic ion mass chromatogram of sample to be tested

圖12 卡那霉素陽性添加樣品特征離子質(zhì)量色譜圖Fig 12 Characteristic ion mass chromatogram of Kanamycin positive sample

2.6.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 在選定的色譜條件下，使用梯度洗脫的方法，可以有效地分離各離子對，在0.2 μg/mL～5 μg/mL的范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=1577.4X+149.29，Y為卡那霉素定量離子峰面積，X(μg/mL)為卡那霉素的濃度，其相關(guān)系數(shù)R2為0.9984，線性良好，見圖13。

圖13 卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig 13 Standard graph of Kanamycin

2.6.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度 卡那霉素以外標(biāo)法計(jì)算，液質(zhì)分離良好，無任何干擾，0.1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，信噪比(S/N)>3，確定為方法的檢測限；0.2 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，信噪比(S/N)>10，確定為方法的定量限。

根據(jù)藥物發(fā)生藥效所需要的可能添加的濃度，檢測限和定量限足以滿足要求。添加濃度50 mg/g，批內(nèi)批間變異系數(shù)均小于10%，陽性添加樣品的回收率在90%～110%(表4)。各特征離子質(zhì)量色譜圖見圖12。

表4 卡那霉素陽性添加回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab 4 Results of Kanamycin positive recovery rate test (n=9)

3 討論與結(jié)論

實(shí)驗(yàn)接到樣品后，先是進(jìn)行了外觀檢查，樣品為一種白色的粉末，在有機(jī)溶劑乙腈中溶解性比較差，在水相較多的溶劑中溶解度很好，懷疑可能是β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類等水溶性比較良好的藥物。為了節(jié)省時(shí)間，同時(shí)打開了兩臺儀器設(shè)備，進(jìn)行流動相的平衡等前期工作，希望檢測同時(shí)進(jìn)行，以最快的時(shí)間出結(jié)果。然后精密稱取了適量的藥物，用水相較多的溶劑進(jìn)行溶解至清澈，進(jìn)行適量稀釋后過濾上機(jī)測試。在這種未知盲樣檢測中，無任何標(biāo)準(zhǔn)可以借鑒，無任何文獻(xiàn)可以參考，完全靠平時(shí)檢驗(yàn)工作的經(jīng)驗(yàn)積累和對藥品事件的敏感度，從接到委托樣品到初步確定為卡那霉素，用時(shí)兩個(gè)多小時(shí)，速度很快。

實(shí)驗(yàn)在初期篩選時(shí)采用超高效液相色譜法，選擇了乙腈(0.05%磷酸)∶水(0.05%磷酸)進(jìn)行梯度洗脫，由于前期做中藥非法添加物的初步篩選工作一直使用這個(gè)流動相，有一定化合物的光譜圖譜庫，比如解熱鎮(zhèn)痛類藥物、β-內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類藥物、氨基糖苷類藥物、大環(huán)內(nèi)酯類藥物、氯霉素類藥物、酰胺醇類藥物、磺胺類藥物、四環(huán)素類藥物等近百種藥物光譜圖譜庫，有著豐富的檢測數(shù)據(jù)庫，通過光譜圖進(jìn)行化合物的初步篩選，通過保留時(shí)間和光譜特征，初步推測為卡那霉素。

在質(zhì)譜方法確證時(shí)，考慮到前期卡那霉素出峰較早，選擇甲醇(0.1%甲酸)∶水(0.1%甲酸)進(jìn)行梯度洗脫，特征離子峰形良好，無干擾，分離度和精密度良好，以外標(biāo)法定量，滿足檢測需求。查閱文獻(xiàn)有應(yīng)用CORTECS HILIC色譜柱，ACQUITY UPLC BEH HILIC C18的相關(guān)報(bào)道[11-12]，實(shí)驗(yàn)用ACQUITY UPLC T3色譜柱進(jìn)行嘗試，雖然保留時(shí)間比較早，但滿足實(shí)驗(yàn)檢測需求，在一天內(nèi)順利完成了檢測任務(wù)。

本方法建立了UPLC-PDA聯(lián)合UPLC-MS/MS法測定未知藥品中的卡那霉素，采用外標(biāo)法，對樣品進(jìn)行提取稀釋后測定，準(zhǔn)確性佳、靈敏度高、檢測限低。通過方法學(xué)考察，本方法完全適合本批次未知藥品中的卡那霉素的確證檢測。