郭文奎，李博文，劉麗波

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030)

0 引 言

母乳是嬰兒成長過程當(dāng)中最自然、最安全、最完整的天然食物，它含有嬰兒成長所需的所有營養(yǎng)。世界衛(wèi)生組織建議，在嬰兒6個(gè)月前給予純母乳喂養(yǎng)，6個(gè)月到2歲或更長時(shí)間內(nèi)，在繼續(xù)母乳喂養(yǎng)的同時(shí)添加輔食[1]。母乳中含有乳鐵蛋白、碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)、脂肪酸和牛磺酸等眾多營養(yǎng)成分。而母乳的營養(yǎng)成分也會(huì)隨著產(chǎn)后母體的變化，以及哺乳的不同階段而發(fā)生變化。同時(shí)，母乳中會(huì)含有大量抗體，對(duì)嬰幼兒健康生長發(fā)育是非常重要的[2]。

母乳低聚糖（HMOs）是一類存在于人乳中的復(fù)雜混合低聚糖，是母乳中的重要成分之一，在母乳中含量為5～15 g/L，具有很高的生物活性。HMOs不僅具有獨(dú)特的益生元作用，可以影響嬰兒腸道菌群的構(gòu)建，而且對(duì)嬰兒的大腦發(fā)育、抗感染、免疫調(diào)節(jié)以及體內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)等都有十分重要的作用[3-4]。有研究表明，HMOs的含量和組成是隨著哺乳期時(shí)間變化而變化的。隨著哺乳時(shí)間的延長，母乳中HMOs的濃度逐漸下降。研究顯示在美國人群中，HMOs的濃度從哺乳期開始10天時(shí)的19.3 g/L降低至120天時(shí)的8.53 g/L[5-6]。

研究HMOs必須解決的關(guān)鍵問題是定性和定量的檢測方法。由于母乳中含有大量的脂肪和蛋白質(zhì)，同時(shí)由于HMOs又是十分復(fù)雜的低聚糖混合物[7-8]，結(jié)構(gòu)多樣，同時(shí)包含多個(gè)同分異構(gòu)體，且沒有內(nèi)在的發(fā)色團(tuán)，使得HMOs的定性和定量檢測具有一定的難度[9-10]。要獲得HMOs的絕對(duì)含量，仍然需要標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法。本試驗(yàn)應(yīng)用LC-MS建立快速、穩(wěn)定、靈敏度高的檢測母乳中低聚糖定性及定量的方法，應(yīng)用該方法分析不同哺乳期過程中各種低聚糖的變化情況。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

1.1.1 母乳樣品采集

選擇黑龍江省哈爾濱地區(qū)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科健康、足月生產(chǎn)、自愿捐獻(xiàn)的22～35歲母親，同時(shí)簽署知情同意書。在醫(yī)院期間取母乳時(shí)間為產(chǎn)后泌乳開始的第3、7天。出院后，樣品由母親產(chǎn)后到院檢查時(shí)收集，確保每月收集1次。收集單側(cè)全部乳汁并混勻后取其中5 mL至凍存管于-80℃冰箱凍存。本研究共收集63位母親的母乳樣品。

1.1.2 試劑

3'-fucosyllacos（3'-FL）、2'-fucosyllacose（2'-FL）、6'-siallyllactose（6'-SL）、3'-siallyllactose（3'-SL）、lacto-N-tetraose（LNT）、lacto-N-neotetraose（LNnT）、Lacto-N-fucopentaoseⅠ（LNFP-Ⅰ），美國Sigma-Aldrich公司；乙腈，美國Fisher公司。所用試劑均為色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters TQ-S電噴霧質(zhì)譜儀，Waters Acquity UPLC system，美國Waters公司；Eppendorf 5430R低溫高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

母乳樣品解凍后，取1 mL乳樣與1 mL純凈水混合均勻，震蕩1 min，冷凍離心機(jī)4 600 g離心10 min，用移液器除去上層脂肪，加入3 mL乙腈震蕩1 min，超聲10 min，冷凍離心機(jī)11 000 g離心10 min，重復(fù)兩次，去除沉淀蛋白，上清液為母乳低聚糖，經(jīng)0.22μm膜過濾后進(jìn)行HMOs組分檢測，并以HMOs標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照外標(biāo)定量分析。

1.3.2 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱：Inertsil Hilic柱(2.1 m×150 mm)；流動(dòng)相：A液為乙腈，B液為50 mol/L乙酸銨溶液(p H 4.5)。樣品置于4℃自動(dòng)進(jìn)樣器中，柱溫40℃，流速400μL/min，進(jìn)樣量5μL。梯度洗脫條件：95%流動(dòng)相A和5%流動(dòng)相B洗脫2 min，然后至13 min流動(dòng)相B由5%至25%，然后至18 min流動(dòng)相B由25%至50%，保持洗脫6 min。

采用Waters TQ-S質(zhì)譜儀在負(fù)離子模式下進(jìn)行質(zhì)譜分析。ESI源條件如下：離子源溫度325℃，離子源電壓（ISVF）：4 000 V；采用MRM模式檢測待測離子對(duì)。

采用skyline軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜質(zhì)譜分離方法

本實(shí)驗(yàn)使用Waters TQ-S電噴霧質(zhì)譜儀通過梯度洗脫的方法分離HMOs，色譜分離圖見圖1，圖2。從圖中可以看出，應(yīng)用該方法可以成功檢測HMOs，6種HMOs標(biāo)準(zhǔn)品出峰保留時(shí)間在10～20 min之間，出峰順序依次為3'-FL、2'-FL、6'-SL、LNnT、3'-SL、LNFP-I。經(jīng)前處理的母乳樣品應(yīng)用該方法進(jìn)行分離檢測時(shí)，6種HMOs均能有效分離。表明實(shí)驗(yàn)中梯度洗脫條件符合HMOs檢測，可進(jìn)一步進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 6種母乳低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖2 母乳低聚糖樣品色譜圖

6種HMOs標(biāo)準(zhǔn)曲線、R2、回收率及RSD見表1，從表中可見：6種HMOs標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，R2均高于0.99，RSD值均小于10%，每種低聚糖回收率均測定符合80%～120%的標(biāo)準(zhǔn)，表明該實(shí)驗(yàn)方法可以對(duì)6種目標(biāo)HMOs進(jìn)行快速、全面的定性及定量分析。

表1 母乳低聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及回收率

2.2 母親泌乳期內(nèi)HMOs含量變化

本實(shí)驗(yàn)采用Waters TQ-S電噴霧質(zhì)譜儀對(duì)不同泌乳期的母乳低聚糖進(jìn)行檢測，我們將不同泌乳期的母乳分為初乳、過渡乳及成熟乳。其中，初乳是生產(chǎn)后第1到第12天的母乳，過渡乳是生產(chǎn)后第13天至第30天的母乳，成熟乳是生產(chǎn)后第2個(gè)月以后的母乳。從表2中我們可以看到，在收集的所有不同泌乳期母乳樣品中，檢測到6種HMOs的組成和含量均在不斷變化。其中2'-FL、6'-SL、LNnT、LNFP-I的含量隨著泌乳期的延長而逐漸降低。6種HMOs中，只有3'-FL的含量隨著泌乳期的延長而逐漸升高，而3'-SL的含量隨著泌乳期的延長含量先降低后升高。從表2中可以看到，HMOs在不同的泌乳期含量不同，泌乳初期相對(duì)含量更多，隨著泌乳時(shí)間的延長，大部分HMOs在母乳中的含量逐漸降低。

表2 不同泌乳階段母乳低聚糖含量變化

2.3 不同分泌型母親泌乳期內(nèi)HMOs變化

2-巖藻糖基乳糖（2'-FL）和3-巖藻糖基乳糖（3'-FL）是重要的母乳低聚糖類，而2'-FL已添加到嬰幼兒配方奶粉中以縮小母乳替代品與母乳間功能性的差距。母親攜帶巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶2(FUT2)基因類型可影響母乳中HMO成分，這直接影響了嬰兒腸道菌群的定植時(shí)間和發(fā)展?；虻耐蛔兛蓪?dǎo)致其編碼的FUT2失活，將FUT2基因處于活化狀態(tài)的人群歸類為分泌型，失活狀態(tài)的人群為非分泌型，而不同分泌型母親在哺乳期所分泌母乳中乳糖巖藻糖基化的過程會(huì)發(fā)生變化[11]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，隨著泌乳期的延長，2'-FL的含量隨著泌乳期的延長在逐漸降低，而3'-FL的含量則逐漸升高。有研究應(yīng)用2'-FL/3’-FL的相對(duì)含量比例進(jìn)行泌乳母親分型，2'-FL/3'-FL的相對(duì)含量比例大于6.5為分泌型母親，而2'-FL/3'-FL的相對(duì)含量比例低于6.5則為非分泌型母親[12]。從表3中我們可以看到，我們所收集的母乳低聚糖的母親多為分泌型母親，分泌型與非分泌型母親的比例為42∶21，分泌型母親占比為66.7%，分泌型母乳中HMO的組成成分不同于非分泌型，特別是2'-FL和3'-FL的含量區(qū)別較大。在分泌型母親的母乳中，2'-FL的含量要高于非分泌型母親母乳的含量，而在非分泌型母親的母乳中，3'-FL的含量要略高于分泌型母親母乳的含量。

表3 不同分泌型母親母乳中低聚糖含量

3 結(jié) 論

3.1 生產(chǎn)方式對(duì)母乳低聚糖含量的影響

通過檢測分析產(chǎn)婦泌乳后母乳低聚糖含量及組分變化情況發(fā)現(xiàn)，通過自然生產(chǎn)的產(chǎn)婦母乳中低聚糖的含量與剖腹產(chǎn)產(chǎn)婦母乳中低聚糖的含量有一定的差異。其中，通過自然生產(chǎn)的產(chǎn)婦母乳中2'-FL、LNFP-I的含量均略高于剖腹產(chǎn)產(chǎn)婦母乳中的含量。而剖腹產(chǎn)產(chǎn)婦母乳中LNnT的含量則略高于自然生產(chǎn)的產(chǎn)婦母乳中的含量。這表明，生產(chǎn)方式可能對(duì)產(chǎn)婦母乳中低聚糖的含量有一定的影響[13]。

3.2 個(gè)體差異對(duì)母乳低聚糖含量的影響

通過采集的63位母親的母乳樣品中6種HMOs的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，個(gè)體差異對(duì)母乳中低聚糖的含量有一定的影響。其中，2'-FL的濃度在母親母乳中的變動(dòng)范圍較大，在泌乳初期達(dá)到最高值，然后隨著泌乳時(shí)間的延長含量逐漸減少。而3'-FL是所有6種HMOs成分中唯一一種含量隨著泌乳時(shí)間延長而基本保持增加的低聚糖。研究發(fā)現(xiàn)，大部分母親的母乳樣品中均含有這6種HM Os，但部分母親的母乳樣品中未檢測到2'-FL及LNFP-I，這表明母體差異對(duì)母乳低聚糖的含量及組分有一定影響[14-15]。

已有研究發(fā)現(xiàn)，HMOs具有調(diào)節(jié)免疫，幫助大腦發(fā)育及調(diào)節(jié)嬰兒腸道菌群等功能，有助于嬰幼兒早期成長發(fā)育[16-17]。上個(gè)世紀(jì)九十年代，許多乳品企業(yè)將一些雙歧桿菌活性低聚糖作為母乳低聚糖的替代物添加到嬰兒配方奶粉中。目前，許多國外生產(chǎn)嬰兒配方粉的乳品企業(yè)已經(jīng)在生物合成母乳低聚糖方面取得了重大成功。目前，經(jīng)歐盟和美國批準(zhǔn)并且能夠商業(yè)化的母乳低聚糖一般是2'-FL、LNnT兩種。在我國，針對(duì)中國母乳HMOs的研究還處于初級(jí)階段，特別是在母乳低聚糖的合成方面研究較少。因此，應(yīng)加大對(duì)中國國內(nèi)不同地區(qū)、不同種族、不同生活習(xí)慣、不同生產(chǎn)方式、不同年齡的產(chǎn)婦母乳收集，建立中國母親母乳中HMOs數(shù)據(jù)庫，為中國自主乳品企業(yè)生產(chǎn)添加母乳低聚糖的嬰兒配方粉提供理論依據(jù)。