周勝花，薛麗娜，宋獻(xiàn)藝

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801）

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR，qRT-PCR）是一種廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)mRNA 表達(dá)量進(jìn)行定量分析的技術(shù)，有定量準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[1-2]。qRT-PCR 包括絕對(duì)定量PCR 和相對(duì)定量PCR。在相對(duì)定量PCR 中，為得到準(zhǔn)確結(jié)果，常常需要引入內(nèi)參基因用以修正不同樣本初始模板純度和濃度以及反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增效率等差異[3]。內(nèi)參基因是一類在不同條件下仍能在所有組織內(nèi)恒定表達(dá)的基因，這類基因在所有組織中都有較高的表達(dá)量[4-5]。常見的內(nèi)參基因有甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（GAPDH）、18S 核糖體RNA 基因（18S rRNA）、β2-微球蛋白（B2M）、beta-肌動(dòng)蛋白基因（ACTβ）等[6-8]。然而，隨著人們認(rèn)識(shí)的深入，便發(fā)現(xiàn)內(nèi)參基因表達(dá)并非絕對(duì)的穩(wěn)定，只有在特定條件下表現(xiàn)出相對(duì)的穩(wěn)定[9]。因此，在進(jìn)行定量分析前篩選穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因?qū)τ趯?shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性具有重要意義。目前，已有大量關(guān)于內(nèi)參基因篩選的研究，可為進(jìn)行綿羊不同組織穩(wěn)定表達(dá)內(nèi)參基因的篩選提供參考[10-13]。

廣靈大尾羊是一種肉毛兼用型的優(yōu)良地方綿羊品種[14]。目前，已有大量通過分子生物技術(shù)手段開展關(guān)于肉質(zhì)、皮毛相關(guān)優(yōu)質(zhì)基因挖掘、分子機(jī)制的研究，但在這些研究中關(guān)于內(nèi)參基因穩(wěn)定性的研究未見報(bào)道。本研究利用qRT-PCR 對(duì)6 種常見的內(nèi)參基因進(jìn)行表達(dá)量分析，并運(yùn)用GeNorm、NormFinder 及BestKeeper 綜合分析了以上基因在廣靈大尾羊皮毛、肉質(zhì)性狀及脂肪代謝相關(guān)組織包括皮膚、背部最長(zhǎng)肌、腎周脂肪、肝臟中的穩(wěn)定性，以期篩選出最佳的內(nèi)參基因，而使后續(xù)基因的定量表達(dá)研究獲得更為準(zhǔn)確可靠的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 隨機(jī)選取同一飼喂條件下的6 月齡廣靈大尾羊6 只，公母各半，屠宰并采集同一位置的背部最長(zhǎng)肌、腎周脂肪、肝臟組織及凈毛后的皮膚組織，迅速投入液氮中，隨后保存于超低溫冰箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA 的提取和cDNA 的合成 提取總RNA 前將各組織粉碎，用液氮研磨皮膚組織，背部最長(zhǎng)肌、腎周脂肪、肝臟組織用磁珠粉碎儀研磨。后續(xù)提取步驟參見Eastep?Super 總RNA 提取說明書進(jìn)行。用Nanodrop-2000c 儀測(cè)定RNA 質(zhì)量，將質(zhì)量合格的各樣本RNA 濃度均稀釋成100 ng/μL。反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)參照GoScript? Reverse Transcription System 試劑盒使用說明構(gòu)建體系，其中含有1 μg RNA。隨后置于PCR 儀中，反應(yīng)條件：25℃ 5 min，42℃ 6 min，70℃ 15 min。反應(yīng)后的產(chǎn)物-20℃保存。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及其特異性驗(yàn)證 在NCBI 上查找并獲得GAPDH、18S rRNA、B2M、ACTβ、RPLPO、YWHAZ基因mRNA 序列，隨后將序列上傳至Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。為驗(yàn)證引物的特異性，參照2×Taq PCR MasterMix 的使用指南構(gòu)建PCR 反應(yīng)體系，隨后置于PCR 儀中，反應(yīng)條件設(shè)置為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃30 s，72℃30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72℃5 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物。

表1 綿羊各候選內(nèi)參基因的引物序列

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè) 將cDNA 按照10-1～10-5稀釋成5 個(gè)梯度作為反應(yīng)的模板，每個(gè)模板重復(fù)3 次，通過Rotor-Gene Q 熒光定量PCR儀分別擴(kuò)增GAPDH、18S rRNA、ACTβ、RPLPO、YWHAZ基因，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。以50 倍稀釋后的cDNA 作為模板檢測(cè)4 個(gè)組織中6 個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)豐度，每個(gè)樣本重復(fù)3 次。qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系的構(gòu)建依據(jù)為QuantiNova SYBR Green PCR Kit 說明：上下游引物（10 μmol/μL）各0.4 μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，cDNA 模板2 μL，補(bǔ)充水至20 μL。反應(yīng)條件設(shè)置為：95℃，2 min；95℃，5 s；60℃，20 s；共30 個(gè)循環(huán)；熔解反應(yīng)的溫度從60℃升至95℃，每5 s上升1℃。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 將梯度稀釋的cDNA 定量擴(kuò)增結(jié)果的Ct值導(dǎo)入Excel 表格，分別以Log（起始濃度）和循環(huán)數(shù)為橫縱坐標(biāo)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，統(tǒng)計(jì)6 個(gè)內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和相關(guān)系數(shù)（R2），根據(jù)公式E%=（10-1/斜率-1）×100%計(jì)算擴(kuò)增效率。

本實(shí)驗(yàn)每個(gè)組織中6 個(gè)樣本，每個(gè)樣本重復(fù)3 次，進(jìn)行qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)，將結(jié)果導(dǎo)入Excel 表格，每個(gè)樣本的3 次重復(fù)的Ct 值取幾何平均值，然后將平均Ct值中最小的設(shè)置為1，采用2-ΔCt（ΔCt=樣本Ct 值-最小Ct 值）公式計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，數(shù)據(jù)導(dǎo)入geNorm和NormFinder 中，得出候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性值及最佳內(nèi)參基因的個(gè)數(shù)。將定量結(jié)果的Ct 值數(shù)據(jù)導(dǎo)入BestKeeper，得出各內(nèi)參基因的穩(wěn)定性值。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA 質(zhì)量檢測(cè)及候選內(nèi)參基因的PCR 結(jié)果 核酸質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果顯示，所有樣本的總RNA 濃度在200～3 000 ng/μL，其中肝臟的濃度最大，均大于2 000 ng/μL，皮膚、腎周脂肪、肝臟組織的濃度均在250 ng/μL 左右。所有樣本A260/A280 值均在2.0 左右。

以皮膚cDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增6 個(gè)候選內(nèi)參基因片段，經(jīng)電泳檢測(cè)（圖1）發(fā)現(xiàn)，GAPDH、18S rRNA、B2M、ACTβ、RPLPO、YWHAZ基因的片段大小與預(yù)期片段大小一致且為單一條帶，說明以上引物擴(kuò)增專一。

圖1 6 個(gè)內(nèi)參基因PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建 由表2 可知，各內(nèi)參基因的斜率在-3.1～-3.5，擴(kuò)增效率在95%～108%，R2均大于99%，說明Log（起始濃度）與循環(huán)數(shù)具有良好的線性關(guān)系，引物的擴(kuò)增效率較好。

表2 綿羊6 個(gè)候選內(nèi)參基因引物擴(kuò)增參數(shù)

2.4 候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

2.4.1 4 個(gè)組織中6 個(gè)內(nèi)參基因Ct 值分析 如圖2 所示，內(nèi)參基因的平均Ct 值為11.2～25.9。18S rRNA是4 個(gè)組織中表達(dá)量最高的內(nèi)參基因（平均Ct=11.7），而YWHAZ是表達(dá)量最低的內(nèi)參基因（平均Ct=24.2），B2M在4 個(gè)組織中的穩(wěn)定性最好。

圖2 綿羊6 個(gè)候選內(nèi)參基因不同組織中Ct 值比較

2.4.2 geNorm 分析 經(jīng)geNorm 軟件分析可知內(nèi)參基因的穩(wěn)定性M 值和變異V 值，M 值越大內(nèi)參基因穩(wěn)定性越差，V 值可決定最佳內(nèi)參基因的個(gè)數(shù)，一般認(rèn)為Vn:Vn+1小于0.15，則最佳內(nèi)參基因個(gè)數(shù)為n 個(gè)[15]。geNorm 分析結(jié)果得出各候選內(nèi)參基因的數(shù)值及排序見表3，在綿羊背部最長(zhǎng)肌中內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序?yàn)?8S rRNA＜ACTβ＜RPLPO＜B2M＜GAPDH=YWHAZ，GAPDH和YWHAZ適合作為內(nèi)參基因。在綿羊腎周脂肪中內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序?yàn)?8S rRNA＜YWHAZ＜RPLPO＜B2M＜ACTβ=GAPDH，ACTβ和GAPDH適合作為內(nèi)參基因。在綿羊肝臟中內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序?yàn)?8S rRNA＜YWHAZ＜B2M＜GAPDH＜ACTβ=RPLPO，ACTβ和RPLPO適合作為內(nèi)參基因。在綿羊皮膚組織中內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序?yàn)锳CTβ＜RPLPO＜YWHAZ＜B2M＜GAPDH=18S rRNA，GAPDH和18S rRNA適合作為內(nèi)參基因。在4 個(gè)組織中內(nèi)參基因穩(wěn)定性的排序?yàn)镚APDH＜YWHAZ＜ACTβ＜B2M＜18S rRNA=RPLPO，18S rRNA和RPLPO適合作為內(nèi)參基因。以上結(jié)果中V2:V3均小于0.15，因此合適的內(nèi)參基因個(gè)數(shù)均為2（圖3）。

表3 geNorm 軟件分析各候選內(nèi)參基因穩(wěn)定值M 及排序

圖3 geNorm 軟件分析候選內(nèi)參基因的配對(duì)差異值V

2.4.3 NormFinder 分析 NormFinder 可計(jì)算出基因表達(dá)穩(wěn)定值（S 值）且選出1 個(gè)最佳的內(nèi)參基因。其中S 值越小，穩(wěn)定性越好[15]。如表4 所示，在綿羊背部最長(zhǎng)肌中內(nèi)參基因穩(wěn)定性的排序?yàn)?8S rRNA＜ACTβ＜YWHAZ＜RPLPO＜B2M＜GAPDH，GAPDH適合作為內(nèi)參基因。在綿羊腎周脂肪中內(nèi)參基因穩(wěn)定性的排序?yàn)?8S rRNA＜YWHAZ＜RPLPO＜B2M＜ACTβ＜GAPDH，GAPDH適合作為內(nèi)參基因。在綿羊肝臟中內(nèi)參基因穩(wěn)定性的排序?yàn)?8S rRNA＜B2M＜ACTβ＜YWHAZ＜GAPDH＜RPLPO，RPLPO適合作為內(nèi)參基因。在綿羊皮膚組織中內(nèi)參基因穩(wěn)定性的排序?yàn)锳CTβ＜YWHAZ＜RPLPO＜GAPDH＜B2M＜18S rRNA，18S rRNA適合作為內(nèi)參基因。在4 個(gè)組織中內(nèi)參基因穩(wěn)定性的排序?yàn)镚APDH＜ACTβ＜YWHAZ＜18S rRNA＜B2M＜RPLPO，RPLPO適合作為內(nèi)參基因。

表4 NormFinder 軟件分析候選內(nèi)參基因穩(wěn)定值S 及排序

2.4.4 BestKeeper 分析 利用BestKeeper 軟件可計(jì)算出內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)偏差（Standard Deviation，SD），SD值越小，穩(wěn)定性越好[15]。BestKeeper 分析得出各候選內(nèi)參基因的數(shù)值及排序結(jié)果（表5）表明，在綿羊背部最長(zhǎng)肌中的排序?yàn)?8S rRNA＜B2M＜RPLPO＜YWHAZ＜ACTβ＜GAPDH，GAPDH適合作為內(nèi)參基因。在綿羊腎周脂肪中排序?yàn)?8S rRNA＜B2M＜YWHAZ＜ACTβ＜RPLPO＜GAPDH，GAPDH適合作為內(nèi)參基因。在綿羊中的排序?yàn)锽2M＜ACTβ＜GAPDH＜18S rRNA＜YWHAZ＜RPLPO，RPLPO適合作為內(nèi)參基因。在綿羊皮膚組織中的排序?yàn)镽PLPO＜YWHAZ＜18S rRNA＜B2M＜GAPDH，GAPDH適合作為內(nèi)參基因。在4 個(gè)組織中的排序?yàn)镚APDH＜YWHAZ＜RPLPO＜ACTβ＜18S rRNA＜B2M，B2M適 合作為內(nèi)參基因。

表5 BestKeeper 軟件分析候選內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)偏差SD 及排序

3 討 論

熒光定量PCR 是目前分子生物學(xué)研究中進(jìn)行定量檢測(cè)基因表達(dá)的一種可靠的技術(shù)，大量關(guān)于分子機(jī)制研究的科研工作均需要這項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行基因表達(dá)差異分析以探究某一分子機(jī)制的真實(shí)面目。齊波等[16]研究11 個(gè)候選基因在豬不同組織中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，肌肉組織中TBP基因和RPL14基因穩(wěn)定性最好，而在肺臟組織中B2M基因和HPRT1基因最為穩(wěn)定，說明在不同組織中內(nèi)參基因的穩(wěn)定性不同。陳瑞等[17]分析6 個(gè)內(nèi)參基因在家兔不同發(fā)育階段中的穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，在家兔胚胎期的心、肝和腎臟組織中表達(dá)最穩(wěn)定的是GAPDH，而在幼齡期和成年期的3 個(gè)組織中HPRTI表達(dá)最為穩(wěn)定。這說明不同發(fā)育階段最為穩(wěn)定的內(nèi)參基因不同。對(duì)于細(xì)胞而言，在不同的體外培養(yǎng)條件下，內(nèi)參基因的表達(dá)量也會(huì)有所改變。如Schmittgen 等[18]研究發(fā)現(xiàn)用血清培養(yǎng)成纖維細(xì)胞后，ACTβ基因和GAPDH基因的表達(dá)量均有不同程度的增加。Hamalainen 等[19]研究表明，在體外培養(yǎng)輔助性T 細(xì)胞分化時(shí)，GAPDH基因表達(dá)量有顯著變化。因此，在基因定量分析前需要進(jìn)行內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析，選擇出在該研究條件下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，以確保定量結(jié)果的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。

目前在綿羊不同組織中進(jìn)行基因定量表達(dá)分析時(shí)，多使用ACTβ和GAPDH作為內(nèi)參基因。如孫國(guó)虎[20]研究背最長(zhǎng)肌中基因差異表達(dá)時(shí)，選用的內(nèi)參基因是ACTβ。高燕等[21]分析肝臟中基因差異表達(dá)時(shí)選用的內(nèi)參基因是GAPDH。趙帥平等[22]分析綿羊不同組織中TRA2B基因差異表達(dá)時(shí)選用的是ACTβ基因校正定量結(jié)果。本研究結(jié)果表明，當(dāng)對(duì)綿羊不同背部最長(zhǎng)肌樣本之間基因表達(dá)差異分析時(shí)，GeNorm、NormFinder及BestKeeper 3 個(gè)軟件均顯示GAPDH表達(dá)穩(wěn)定性最好，可以作為內(nèi)參基因；在綿羊腎周脂肪中最佳的內(nèi)參基因樣本之間基因表達(dá)差異分析時(shí)，3 個(gè)軟件均顯示GAPDH表達(dá)穩(wěn)定性最好，可以作為內(nèi)參基因；當(dāng)對(duì)綿羊不同皮膚樣本之間基因表達(dá)差異分析時(shí)，GeNorm 和NormFinder 軟件均顯示18S rRNA表達(dá)穩(wěn)定性最好，而GeNorm 和BestKeeper 軟件顯示GAPDH表達(dá)穩(wěn)定性最好。鄭嫩珠等[23]研究表明GAPDH是校正色素沉積相關(guān)基因TYR、MITF和ASIP最優(yōu)的內(nèi)參基因，因此對(duì)于皮膚中關(guān)于色素相關(guān)基因的研究選擇GAPDH校正。當(dāng)對(duì)綿羊4 個(gè)組織之間基因表達(dá)差異分析時(shí)，GeNorm 和NormFinder 軟件均顯示RPLPO表達(dá)穩(wěn)定性最好，而BestKeeper 軟件顯示B2M表達(dá)穩(wěn)定性最好。這可能是由于3 款軟件采用不同軟件運(yùn)算方法，導(dǎo)致候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排序稍有不同[24]。因此，為獲得更準(zhǔn)確、更可靠的熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，應(yīng)該考慮到實(shí)際應(yīng)用中的具體要求及實(shí)驗(yàn)條件等諸多影響因素，通過嚴(yán)格篩選，最終確定合適的內(nèi)參基因。

4 結(jié) 論

本研究通過GeNorm、NormFinder 和BestKeeper 軟件綜合分析了綿羊4 個(gè)重要的組織中6 種內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，在綿羊背部最長(zhǎng)肌和腎周脂肪中，3 個(gè)軟件都得出GAPDH表達(dá)最穩(wěn)定；在肝臟中，3 個(gè)軟件都得出RPLPO表達(dá)最穩(wěn)定；在皮膚中，GeNorm 和NormFinder 均得出18S rRNA表達(dá)最穩(wěn)定，而GeNorm和BestKeeper 均得出GAPDH表達(dá)最穩(wěn)定，所以可選取以上2 個(gè)基因作為該條件下的校正基因。比較4 個(gè)組織中表達(dá)最穩(wěn)定的基因時(shí)，GeNorm 和NormFinder 均得出RPLPO表達(dá)最穩(wěn)定，而BestKeeper 得出B2M表達(dá)最穩(wěn)定，所以可選取以上2 個(gè)基因作為該條件下的校正基因。