李建國，王 穎，李玥天，燕 子，趙 欣，張 宇

(1.山西醫(yī)科大學(xué) 生理學(xué)系 細(xì)胞生理學(xué)教育部重點實驗室，山西 太原 030001；2.四川大學(xué) 華西口腔醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041)

重癥抑郁障礙(major depressive disorder)嚴(yán)重影響人類健康[1]。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體拮抗劑(如MK-801)，通過腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)，快速發(fā)揮抗抑郁作用并持續(xù)數(shù)天[2]。BDNF包括成熟腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(mature BDNF,mBDNF)和前體BDNF(precursor BDNF,proBDNF)兩種，其中，mBDNF具有促神經(jīng)元存活和突觸可塑性作用，proBDNF則起相反作用[3]。二者的動態(tài)平衡通過調(diào)節(jié)大腦結(jié)構(gòu)和功能發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)，但NMDA受體拮抗劑調(diào)控mBDNF和proBDNF動態(tài)平衡的機制仍不清楚。

BDNF表達多種轉(zhuǎn)錄本，各自翻譯不同的mBDNF和proBDNF，并維持二者的動態(tài)平衡[4]。表觀遺傳機制調(diào)控基因表達，具體包括DNA的甲基化修飾、組蛋白的乙?；?、甲基化或磷酸化修飾以及非編碼RNAs調(diào)控等。其中，組蛋白乙酰化修飾可通過松散染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)促進某些基因的轉(zhuǎn)錄，并且此修飾過程受到組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)調(diào)控[5]。本研究選用慢性口服皮質(zhì)酮(corticosterone,CORT)制備抑郁大鼠模型，觀察組蛋白乙?；揎椩贛K-801調(diào)節(jié)海馬DG區(qū)mBDNF和proBDNF表達中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：SPF級雄性SD大鼠(200～250 g)(北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK 2016-0002)，在12/12 h的光/暗周期下飼養(yǎng)，并可自由獲取食物和水。所有動物實驗程序均按照中國實驗動物飼養(yǎng)管理和使用指南進行。

1.1.2 主要試劑：CORT(Aladdin公司)；辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)(Selleck公司)；抗mBDNF抗體和抗proBDNF抗體(Abcam公司)，抗β-actin抗體(Santa Cruz公司)；HRP標(biāo)記的二抗和ECL超敏發(fā)光液(博士德公司)；丙烯酰胺(Sigma-Aldrich公司)；Bradford蛋白定量試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)，ECL Plus檢測試劑盒(GE Healthcare Bio Sciences公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組及處理：將大鼠分為對照(control)組；CORT組，將CORT(50 μg/mL)溶解于飲用水中，首先給藥2周，接著為50% 初始CORT濃度給藥3 d，最后為25% 初始CORT濃度給藥4 d，然后恢復(fù)為正常飲用水進行后續(xù)實驗；CORT+MK-801組，抑郁模型大鼠在實驗前8 h腹腔注射MK-801(0.3 mg/kg)；CORT+SAHA組，抑郁模型大鼠在實驗前6 h腹腔注射SAHA(50 mg/kg)；以及CORT+MK-801+SAHA組，抑郁模型大鼠在實驗前8 h腹腔注射MK-801(0.3 mg/kg)，實驗前6 h腹腔注射SAHA(50 mg/kg)。每組動物為10只。

1.2.2 高架十字迷宮實驗檢測焦慮樣行為：在實驗第23天，將大鼠放置在一個十字形狀裝置的中心。裝置離地500 mm，兩個閉臂和兩個開臂分別從中心伸出(長425 mm，寬10 mm)，閉臂平臺兩側(cè)的側(cè)板高225 mm，開臂兩側(cè)的側(cè)板高1 mm，以防止動物墜落。記錄動物5 min內(nèi)在閉臂和開臂上所停留的時間并進行分析(成都泰盟軟件有限公司)。實驗是在昏暗光線條件下的隔音室中進行。

1.2.3 蔗糖偏好實驗檢測快感缺失：在第24～26天，給大鼠2瓶5%蔗糖溶液1 d，然后給大鼠飲用水1 d，第3天單獨飼養(yǎng)正常組大鼠和抑郁模型組大鼠，分別給予一瓶飲用水和一瓶5%蔗糖溶液。蔗糖偏好以百分比(蔗糖消耗量×100/總消耗量)計算。

1.2.4 曠場實驗檢測焦慮樣行為：曠場箱位于一個昏暗光線條件下的隔音室中，曠場箱長、寬、高均為50 cm，無蓋，內(nèi)壁涂黑。在第27天，將大鼠單獨放置在曠場的中心，讓大鼠探索5 min。記錄動物在曠場中央和角落的時間并進行分析(成都泰盟軟件有限公司)。

1.2.5 強迫游泳實驗檢測絕望癥狀：實驗在安靜的環(huán)境中進行，在第28天，將大鼠單獨放置在水箱中5 min，水箱(高445 mm×直徑200 mm)裝滿25 ℃水，深度300 mm，記錄動物在水箱中靜止不動的時間并進行分析(成都泰盟軟件有限公司)。

1.2.6 蛋白免疫印跡檢測mBDNF和proBDNF：在行為檢測后，大鼠被安樂死后取腦，制備1 mm厚海馬冠狀切片，解剖顯微鏡下分離海馬背側(cè)和腹側(cè)DG區(qū)。組織勻漿提取總蛋白。從每個樣品中提取50 μg蛋白質(zhì)，在12% SDS-PAGE上分離蛋白質(zhì)組分，轉(zhuǎn)膜到PVDF膜。用針對mBDNF(1∶5 000)、proBDNF(1∶5 000)或β-actin(1∶2 000)的一抗4 ℃下孵育過夜，然后二抗孵育1.5 h。使用化學(xué)發(fā)光法顯影，ImageJ軟件分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MK-801減輕抑郁模型大鼠的抑郁樣行為

慢性口服CORT誘發(fā)大鼠抑郁樣行為(圖1)。給予MK-801減少動物在閉臂停留的時間(P<0.01)(圖1B)，增加在開臂停留的時間(P<0.01)(圖1C)。MK-801降低蔗糖偏好實驗中的蔗糖偏好度(P<0.05)(圖1D)。MK-801減少在角落停留的時間(P<0.01)(圖1E)，增加在中心區(qū)停留的時間(P<0.01)(圖1F)。MK-801增加動物在水中的漂浮不動時間(P<0.05)(圖1G)。去乙酰化酶拮抗劑SAHA亦可減輕動物抑郁樣行為(P<0.05或P<0.01)(圖1B～G)。提前MK-801處理后，再給予SAHA，則未見其抗抑郁效應(yīng)在前者的基礎(chǔ)上進一步增強(圖1B～G)。

A.time scheme of the experimental procedure;B,C.elevated plus maze (EPM);D.sucrose preference test (SPT);E,F.open-field test (OFT);G.forced swim test (FST);*P<0.05,**P<0.01 compared with CORT;#P<0.05,##P<0.01 compared with control group;WB.Western blot圖1 MK-801減輕抑郁模型大鼠的抑郁樣行為Fig 1 MK-801 attenuated the depressive-like behaviors in a rat model of depression n=9)

2.2 MK-801增加抑郁模型大鼠腹側(cè)海馬DG區(qū)mBDNF的表達，降低proBDNF的表達

CORT組大鼠腹側(cè)DG中mBDNF表達降低，proBDNF表達升高(P<0.05)(圖2)。CORT+MK-801組、CORT+SAHA組和CORT+MK-801+SAHA組大鼠腹側(cè)DG中mBDNF的表達增加，proBDNF表達降低(P<0.05)(圖2)。與CORT+MK-801組和CORT+SAHA組相比，CORT+MK-801+SAHA組大鼠腹側(cè)海馬DG中mBDNF和proBDNF的表達未見顯著性變化(圖2)。

A.representative Western blots of mBDNF and proBDNF;B.quantitative data of mBDNF normalized with the level of β-actin;C.quantitative data of proBDNF normalized with the level of β-actin;*P<0.05 compared with CORT group;#P<0.05 compared with control group圖2 MK-801增加抑郁模型大鼠腹側(cè)海馬DG區(qū)mBDNF的表達并降低proBDNF的表達Fig 2 MK-801 increased the expression of mBDNF and decreased the expression of proBDNF in the ventral hippocampal DG of depression model rats n=9)

2.3 MK-801增加抑郁模型大鼠背側(cè)海馬DG區(qū)mBDNF的表達，降低proBDNF的表達

CORT組大鼠背側(cè)DG中mBDNF表達降低，proBDNF表達升高(P<0.05)(圖3)。CORT+MK-801組、CORT+SAHA組和CORT+MK-801+SAHA組大鼠背側(cè)DG中mBDNF的表達增加，proBDNF表達降低(P<0.05)(圖3)。與CORT+MK-801組和CORT+SAHA組相比，CORT+MK-801+SAHA組大鼠背側(cè)海馬DG中mBDNF和proBDNF的表達未見顯著性變化(圖3)。

A.representative Western blots of mBDNF and proBDNF;B.quantitative data of mBDNF normalized with the level of β-actin;C.quantitative data of proBDNF normalized with the level of β-actin;*P<0.05 compared with CORT group;#P<0.05 compared with control group圖3 MK-801增加抑郁模型大鼠背側(cè)海馬DG區(qū)mBDNF的表達并降低proBDNF的表達Fig 3 MK-801 increased the expression of mBDNF and decreased the expression of proBDNF in the dorsal hippocampal DG of depression model rats n=9)

3 討論

NMDA受體非競爭性拮抗劑，如氯胺酮或MK-801，對抑郁癥有快速治療作用，然而氯胺酮的擬精神病作用和成癮性限制了其廣泛應(yīng)用[2,6]。MK-801通過物理阻斷和促進離子通道關(guān)閉來拮抗NMDA受體功能。因此，本研究選擇MK-801來觀察NMDA受體非競爭性拮抗劑的抗抑郁效應(yīng)。與其他研究一致，MK-801減弱CORT處理大鼠的抑郁樣行為[7]。

有研究表明，BDNF在海馬腦區(qū)分布最為顯著，尤其是在海馬DG區(qū)。長期應(yīng)激導(dǎo)致機體皮質(zhì)激素升高，進而毒性損傷海馬區(qū)神經(jīng)元，表現(xiàn)為樹突萎縮、突觸減少和神經(jīng)元死亡[8]。在本研究中，CORT處理大鼠海馬DG區(qū)mBDNF表達降低，proBDNF表達增加，與抑郁癥患者海馬體積小于正常的報道相一致[9]。同時，MK-801不但顯著增加海馬DG區(qū)mBDNF表達，而且可以降低proBDNF表達，表明mBDNF和proBDNF的動態(tài)平衡能夠通過修復(fù)海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能參與MK-801的抗抑郁作用。

HDACs通過降低組蛋白賴氨酸乙?；秸{(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。HDACs包括4種類型，分別為HDAC Ⅰ、HDAC Ⅱ、HDAC Ⅲ和HDAC Ⅳ[10]。HDACs在大腦中表達各異，其中，HDAC I在海馬腦區(qū)高表達。SAHA能抑制HDAC I的酶活性，全身給予SAHA可顯著改變海馬腦區(qū)基因轉(zhuǎn)錄[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，SAHA對mBDNF和proBDNF表達的影響效應(yīng)在提前給予大鼠MK-801處理后未見進一步的顯著變化，提示組蛋白乙?；贛K-801對mBDNF和proBDNF表達的調(diào)控中起關(guān)鍵作用。

BDNF可以轉(zhuǎn)錄11種轉(zhuǎn)錄本，其各自翻譯不同的mBDNF和proBDNF[4]。給予MK-801后，海馬腦區(qū)組蛋白乙酰化水平升高，通過形成松散的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，促進BDNF一部分轉(zhuǎn)錄本表達，并增加mBDNF的表達。組蛋白乙酰化水平升高引起的proBDNF表達降低可能是通過抑制BDNF基因另一部分轉(zhuǎn)錄本表達導(dǎo)致。但是，組蛋白乙酰化抑制這部分轉(zhuǎn)錄本表達的具體機制需要進一步的研究，已有研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白H4K16乙酰化會通過招募甲基化修飾酶調(diào)控組蛋白甲基化水平，而組蛋白甲基化是抑制基因轉(zhuǎn)錄的一個重要因素[12]。

大鼠海馬的形狀長而彎曲，沿著背側(cè)向腹側(cè)延伸，背側(cè)海馬介導(dǎo)認(rèn)知功能和記憶功能，而腹側(cè)海馬參與情緒和情感過程[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，CORT誘導(dǎo)動物抑郁樣行為的同時，可以降低大鼠背側(cè)海馬DG區(qū)和腹側(cè)海馬DG區(qū)mBDNF的表達，增加proBDNF的表達，MK-801逆轉(zhuǎn)了mBDNF和proBDNF在海馬兩個DG區(qū)域的表達。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，海馬整個DG區(qū)存在顯著的神經(jīng)發(fā)生，并與抑郁癥負(fù)相關(guān)[14]。mBDNF在神經(jīng)發(fā)生中起著重要作用，其可促進神經(jīng)干細(xì)胞的增殖并促進后代神經(jīng)元的成熟和存活[15]。因此，海馬功能比簡單的背側(cè)記憶和腹側(cè)情緒范式復(fù)雜，mBDNF和proBDNF的動態(tài)平衡可能通過影響DG區(qū)的神經(jīng)發(fā)生，影響海馬背側(cè)認(rèn)知系統(tǒng)和腹側(cè)情感系統(tǒng)對情緒語境的調(diào)節(jié)作用，共同對抑郁癥發(fā)揮調(diào)控效應(yīng)。

綜上所述，MK-801的抗抑郁作用可能與組蛋白乙?；黾觤BDNF表達和降低proBDNF表達有關(guān)，提示調(diào)控mBDNF和proBDNF在背側(cè)和腹側(cè)海馬DG區(qū)的動態(tài)平衡可能是治療抑郁癥的理想靶點。