岳宗進(jìn)，劉汝銀，于露，王新立，馮仲鍇，王西彬

河南省中醫(yī)院脊柱科，鄭州 450000

約40%的椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IDD)患者會(huì)出現(xiàn)下腰痛，其中10%的患者長期處于殘疾狀態(tài)，給正常生活帶來極大不便[1]。IDD發(fā)生時(shí)，椎間盤內(nèi)的細(xì)胞可分泌大量炎性因子[主要包括白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)等]，促進(jìn)椎間盤細(xì)胞自噬、衰老和凋亡，進(jìn)一步加速IDD[2]。補(bǔ)骨脂素是中藥補(bǔ)骨脂的主要有效成分，有研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)碘乙酸單鈉誘導(dǎo)的大鼠骨關(guān)節(jié)炎療效顯著[3]，但對(duì)于IDD的療效尚未明確。S期激酶相關(guān)蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2，SKP2)是一種E3泛素連接酶，有研究發(fā)現(xiàn)其可抑制IDD時(shí)髓核細(xì)胞的凋亡[4]。采用補(bǔ)骨脂素干預(yù)晚期皮膚T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系可促進(jìn)泛素特異性肽酶(USP)的表達(dá)[5]，且USP可激活SKP2而促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展[6]，由此推測，補(bǔ)骨脂素可能對(duì)SKP2具有調(diào)控作用。有研究發(fā)現(xiàn)，甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(parathyroid hormone-related protein，PTHrP)在IDD的進(jìn)展過程中表達(dá)增加[7]。在腫瘤骨轉(zhuǎn)移過程中，補(bǔ)骨脂素可降低PTHrP蛋白的表達(dá)[8]。本研究旨在探討補(bǔ)骨脂素對(duì)炎癥環(huán)境下髓核細(xì)胞退變的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 補(bǔ)骨脂素購自北京百奧萊博科技有限公司(貨號(hào)：BP1041)；IL-1β、TNF-α和PTHrP重組蛋白購自北京百普賽斯生物科技股份有限公司；基質(zhì)金屬蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3，MMP-3)、MMP-13和IL-6 ELISA試劑盒購自德國Qiagen公司；兔抗人Ⅱ型膠原蛋白(collagen type 2，Col Ⅱ)和SKP2單克隆抗體一抗購自美國Invitrogen公司；兔抗人PTHrP、沉默信號(hào)調(diào)節(jié)子1(silent information regulator 1，SIRT1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)多克隆抗體一抗以及兔抗Flag和Myc標(biāo)簽單克隆抗體一抗購自英國Abcam公司；鼠抗人蛋白聚糖單克隆抗體一抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠和山羊抗兔二抗購自美國Sigma公司；SKP2短發(fā)夾RNA(shRNA)表達(dá)載體、SKP2慢病毒過表達(dá)載體(LV-SKP2)、PTHrP慢病毒過表達(dá)載體(LVPTHrP)以及對(duì)應(yīng)陰性對(duì)照雜亂干擾和空載體購自美國Merek公司；pRK5質(zhì)粒、Flag、HA和Myc標(biāo)簽抗體購自美國Millipore公司；胎牛血清(FBS)購自美國IBM公司；DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶和HEK293T細(xì)胞購自美國Gibco公司；SIRT1激活劑SRT1720購自美國MedChemExpress公司；碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液、ECL發(fā)光液和BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo公司；活性氧(ROS)檢測試劑盒購自北京BioTeke公司。pRK5-Myc-SKP2、pRK5-Flag-PTHrP和pRK5-HA-Ubiquitin質(zhì)粒由上海生工生物工程股份有限公司構(gòu)建。凝膠成像分析儀購自廣州瑞豐實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LSM780激光掃描共聚焦顯微鏡購自德國蔡司公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及處理 人髓核細(xì)胞株(human nucleus pulposus cells，HNPCs)購自寧波明舟生物科技有限公司。HNPCs細(xì)胞在含10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，1:3傳代，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。設(shè)置對(duì)照組、IL-1β+TNF-α組、補(bǔ)骨脂素(10 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L)組、補(bǔ)骨脂素(25 μmol/L)+SKP2干擾或過表達(dá)組、補(bǔ)骨脂素+PTHrP重組蛋白(100 nmol/L)組與補(bǔ)骨脂素+PTHrP重組蛋白+沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)激活劑SRT1720(1 μmol/L)組。對(duì)照組：加入等體積Hanks'溶液；IL-1β+TNF-α組：使用10 ng/ml IL-1β和50 ng/ml TNF-α誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h建立椎間盤退變細(xì)胞模型；補(bǔ)骨脂素組：在IL-1β和TNF-α誘導(dǎo)后，分別加入10、25、50 μmol/L補(bǔ)骨脂素孵育72 h；補(bǔ)骨脂素+SKP2干擾或過表達(dá)組：分別與20 nmol/L SKP2 shRNA或5 μg/ml LV-SKP2轉(zhuǎn)染48 h后，加入補(bǔ)骨脂素、IL-1β和TNF-α共同孵育48 h，對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照加入等體積雜亂干擾或空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h；補(bǔ)骨脂素+PTHrP重組蛋白組：在IL-1β和TNF-α誘導(dǎo)后，加入25 μmol/L補(bǔ)骨脂素和100 nmol/L PTHrP重組蛋白共同孵育48 h；補(bǔ)骨脂素+PTHrP重組蛋白+SRT1720組：同補(bǔ)骨脂素+PTHrP重組蛋白組處理后，加入1 μmol/L SRT1720(溶于DMSO)孵育48 h。

1.3流式細(xì)胞術(shù)檢測髓核細(xì)胞凋亡情況 將HNPCs以2×105個(gè)/ml的密度接種于培養(yǎng)基中，孵育72 h，收集細(xì)胞。用預(yù)冷PBS洗滌3次，將細(xì)胞重懸在含有PI的緩沖液中，室溫培養(yǎng)15 min，使用BD LSRFortessa細(xì)胞分析儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.4Western blotting檢測髓核細(xì)胞中SKP2、PTHrP、SIRT1、Col Ⅱ和蛋白聚糖蛋白的表達(dá)水平 使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞并提取總蛋白，使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。上樣30 μg，行10% SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜；加入一抗SKP2(1:200)、PTHrP(1:500)、SIRT1(1:1000)、Col Ⅱ(1:2000)、鼠單克隆蛋白聚糖抗體(1:1000)和GAPDH(1:10000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠(1:1000)或山羊抗兔(1:25 000)二抗，室溫孵育2 h，洗膜，加入ECL顯色液顯色。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH條帶灰度值。

1.5ELISA法測定髓核細(xì)胞中MMP-3、MMP-13和IL-6的含量 將HNPCs接種于6孔板中(3×106個(gè)/孔)，待細(xì)胞處理完成后24 h，收集培養(yǎng)基，使用ELISA試劑盒測定MMP-3、MMP-13和IL-6的含量。

1.6DCFDA探針法檢測髓核細(xì)胞內(nèi)ROS水平 使用ROS檢測試劑盒，按照說明書步驟測定髓核細(xì)胞內(nèi)ROS水平。用無菌PBS洗滌細(xì)胞2次，將細(xì)胞在黑暗中于37 ℃下用10 μmol/L DCFDA染色20 min，然后每4 min混合1次。用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，以減少過量DCFDA的干擾。使用LSM780激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)檢測DCFDA熒光強(qiáng)度。

1.7蛋白質(zhì)免疫共沉淀(Co-IP)實(shí)驗(yàn)分析SKP2與PTHrP蛋白的相互作用 使用在線數(shù)據(jù)庫UbiBrowser(http://ubibrowser.ncpsb.org/ubibrowser/home/index)預(yù)測SKP2與PTHrP蛋白的相互作用。HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，待細(xì)胞長至80%融合時(shí)，分別加入1 mg/ml質(zhì)粒[帶有Myc標(biāo)簽的SKP2(Myc-SKP2)質(zhì)粒和帶有Flag標(biāo)簽的PTHrP(Flag-PTHrP)質(zhì)粒]在饑餓條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24 h后吸取培養(yǎng)液，加入1 ml PBS并刮取細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中；吸取100 μl作為input。將剩余的細(xì)胞懸液在室溫下6000 r/min離心2 min，去上清，加入1 ml細(xì)胞裂解緩沖液[20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)、150 mmol/L NaCl、1% Triton X-100、0.5 mmol/L EDTA、0.5 mmol/L DTT]充分混勻，4 ℃下3000 r/min離心1 min，去上清，加入預(yù)冷PBS重懸，重復(fù)3次，加入等體積PBS充分混勻，取適量預(yù)混液加入抗體[兔抗Flag標(biāo)簽抗體一抗(1:30)、兔抗Myc標(biāo)簽抗體一抗(5 μg/ml)和山羊抗兔二抗(1:50)]，采用Western blotting檢測。

1.8泛素化實(shí)驗(yàn)檢測PTHrP泛素化水平HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，在變性緩沖液[6 mol/L Tris-HCl、0.1 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4(pH 8.0)、10 mmol/L咪唑]中收集細(xì)胞。裂解液與Ni-NTA瓊脂糖珠孵育3 h，然后用變性緩沖液洗滌4次，用低鹽緩沖液[25 mmol/L Tris-HCl(pH 6.8)、20 mmol/L咪唑]洗滌2次。加入50 μl含200 mmol/L咪唑的2×SDS蛋白上樣緩沖液，95 ℃金屬浴15 min。離心取上清，采用Western blotting檢測。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Tukey HSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1補(bǔ)骨脂素對(duì)炎癥環(huán)境下髓核細(xì)胞退變的影響

與對(duì)照組比較，IL-1β+TNF-α組髓核細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與IL-1β+TNF-α組比較，補(bǔ)骨脂素處理后髓核細(xì)胞凋亡率以劑量依賴的方式降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖1A、B)。與對(duì)照組比較，IL-1β+TNF-α組髓核細(xì)胞中IL-6、ROS、MMP-3和MMP-13水平明顯升高，SKP2、Col Ⅱ和蛋白聚糖蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)；與IL-1β+TNF-α組比較，補(bǔ)骨脂素處理后髓核細(xì)胞中IL-6、ROS、MMP-3和MMP-13水平以劑量依賴的方式降低，SKP2、Col Ⅱ和蛋白聚糖蛋白表達(dá)水平以劑量依賴的方式升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖1C–J)。

圖1 補(bǔ)骨脂素對(duì)炎癥環(huán)境下HNPCs退變的影響Fig.1 Effects of psoralen on HNPCs degeneration in an inflammatory environment

2.2補(bǔ)骨脂素調(diào)控SKP2蛋白表達(dá)對(duì)炎癥環(huán)境下髓核細(xì)胞退變的影響 與IL-1β+TNF-α組比較，補(bǔ)骨脂素+雜亂干擾組髓核細(xì)胞凋亡率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與補(bǔ)骨脂素+雜亂干擾組比較，補(bǔ)骨脂素+SKP2干擾組髓核細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與IL-1β+TNF-α組比較，補(bǔ)骨脂素+雜亂干擾組髓核細(xì)胞中SKP2、Col Ⅱ和蛋白聚糖蛋白表達(dá)水平明顯升高，IL-6、ROS、MMP-3和MMP-13水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與補(bǔ)骨脂素+雜亂干擾組比較，補(bǔ)骨脂素+SKP2干擾組髓核細(xì)胞中SKP2、Col Ⅱ和蛋白聚糖蛋白表達(dá)水平明顯降低，IL-6、ROS、MMP-3和MMP-13水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖2)。

圖2 SKP2干擾對(duì)炎癥環(huán)境下HNPCs退變和細(xì)胞外基質(zhì)的影響Fig.2 Effects of SKP2 interference on HNPCs degeneration and extracellular matrix in an inflammatory environment

2.3SKP2與PTHrP蛋白的相互作用分析 在線數(shù)據(jù)庫UbiBrowser預(yù)測結(jié)果顯示，SKP2與PTHrP蛋白之間存在直接相互作用。Western blotting檢測結(jié)果顯示，Myc抗體和Flag抗體均檢測到SKP2和PTHrP蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了SKP2與PTHrP蛋白的相互作用(圖3)。

圖3 SKP2與PTHrP蛋白的相互作用分析Fig.3 Analysis of the interaction between SKP2 and PTHrP proteins

2.4補(bǔ)骨脂素對(duì)SKP2介導(dǎo)的PTHrP泛素化水平的影響 泛素化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-1β和TNF-α誘導(dǎo)可降低SKP2介導(dǎo)的PTHrP泛素化水平，而添加補(bǔ)骨脂素可升高SKP2介導(dǎo)的PTHrP泛素化水平(圖4A)。Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，IL-1β+TNF-α組髓核細(xì)胞中SKP2蛋白表達(dá)水平明顯降低，PTHrP蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與IL-1β+TNF-α組比較，補(bǔ)骨脂素+空載體組髓核細(xì)胞中SKP2蛋白表達(dá)水平明顯升高，PTHrP蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與補(bǔ)骨脂素+空載體組比較，補(bǔ)骨脂素+SKP2過表達(dá)組髓核細(xì)胞中SKP2蛋白表達(dá)水平明顯升高，PTHrP蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖4B–D)。

圖4 補(bǔ)骨脂素調(diào)控SKP2介導(dǎo)的PTHrP泛素化Fig.4 Psoralen in regulation of SKP2-mediated PTHrP ubiquitination

2.5補(bǔ)骨脂素調(diào)控PTHrP對(duì)SIRT1活化和炎癥環(huán)境下髓核細(xì)胞退變的影響 與對(duì)照組比較，IL-1β+TNF-α組髓核細(xì)胞中SIRT1蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與IL-1β+TNF-α組比較，補(bǔ)骨脂素組髓核細(xì)胞中PTHrP蛋白表達(dá)水平明顯降低，SIRT1蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與補(bǔ)骨脂素組比較，補(bǔ)骨脂素+PTHrP重組蛋白組髓核細(xì)胞凋亡率、ROS、IL-6、MMP-3、MMP-13和PTHrP蛋白表達(dá)水平明顯升高，SIRT1、Col Ⅱ和蛋白聚糖蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與補(bǔ)骨脂素+PTHrP重組蛋白組比較，補(bǔ)骨脂素+PTHrP重組蛋白+SRT1720組髓核細(xì)胞中PTHrP蛋白表達(dá)水平無明顯變化(P＞0.05)，SIRT1、Col Ⅱ和蛋白聚糖蛋白表達(dá)水平明顯升高，細(xì)胞凋亡率、ROS、IL-6、MMP-3、MMP-13水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖5)。

3 討 論

下腰痛是臨床常見疾病，而IDD是導(dǎo)致此類疾病的主要原因[1,9]。椎間盤主要由髓內(nèi)核構(gòu)成，并被纖維環(huán)包圍。髓核細(xì)胞是髓內(nèi)核中的主要細(xì)胞類型，負(fù)責(zé)合成細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分，包括Col Ⅱ和蛋白聚糖蛋白[10-11]，這些蛋白是維持椎間盤正常功能的重要因素。IDD發(fā)生時(shí)，髓核細(xì)胞可分泌大量炎性因子，如IL-1β和TNF-α等[2]。強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致髓核細(xì)胞合成代謝與分解代謝失衡，如分解代謝因子MMP-3和MMP-13的產(chǎn)生增加，合成代謝因子Col Ⅱ和蛋白聚糖蛋白的表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致髓核細(xì)胞過度退變[12]，最終引發(fā)或加速IDD進(jìn)展。

補(bǔ)骨脂素是中藥補(bǔ)骨脂的活性成分，既往研究表明其具有很強(qiáng)的抗炎作用，可有效抑制TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞ECM降解和滑膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減輕大鼠骨關(guān)節(jié)炎癥狀[3]。目前補(bǔ)骨脂素對(duì)炎癥環(huán)境下髓核細(xì)胞功能的影響尚不清楚。本研究采用補(bǔ)骨脂素干預(yù)IL-1β和TNF-α誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞，結(jié)果顯示，細(xì)胞炎性因子IL-6、ROS水平及細(xì)胞凋亡率明顯降低，Col Ⅱ和蛋白聚糖蛋白表達(dá)水平明顯增高，表明髓核細(xì)胞ECM降解得到明顯改善。有研究使用補(bǔ)骨脂素與UVA光化學(xué)療法干預(yù)皮膚T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)泛素特異性蛋白酶2(USP2)的表達(dá)水平明顯升高[5]。也有研究發(fā)現(xiàn)，在退化的椎間盤樣本中，SKP2的表達(dá)水平明顯降低，且SKP2過表達(dá)可抑制IL-1β誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞退變，促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂素孵育能有效促進(jìn)IL-1β和TNF-α誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞中SKP2蛋白的表達(dá)，而SKP2下調(diào)后髓核細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及ECM降解明顯增強(qiáng)。有研究對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型小鼠灌服含有補(bǔ)骨脂的湯藥，發(fā)現(xiàn)小鼠骨轉(zhuǎn)移灶中細(xì)胞因子IL-8和PTHrP蛋白表達(dá)水平明顯降低[8]。另有研究發(fā)現(xiàn)，IDD進(jìn)展時(shí)PTHrP mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高[7]。本研究使用在線數(shù)據(jù)庫UbiBrowser進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，SKP2與PTHrP蛋白之間具有直接相互作用，且通過Western blotting發(fā)現(xiàn)二者可以結(jié)合，提示補(bǔ)骨脂素可促進(jìn)SKP2介導(dǎo)的PTHrP泛素化。

SIRT1通路能夠調(diào)節(jié)各種細(xì)胞生物學(xué)過程，包括凋亡、轉(zhuǎn)錄、血管生成和代謝等，參與防止細(xì)胞衰老和延長生物體壽命的一系列生命活動(dòng)[13]。SIRT1通路在IDD進(jìn)展中的保護(hù)作用已被證實(shí)[14]。據(jù)報(bào)道，SIRT1可抑制c-Fos和c-Jun的磷酸化，從而抑制IL-1β誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞退變[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，PTHrP基因敲入小鼠骨骼組織中SIRT1蛋白的表達(dá)水平降低[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，在退變的髓核細(xì)胞中添加PTHrP重組蛋白可抑制SIRT1蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和ECM降解，而SIRT1通路激活可逆轉(zhuǎn)PTHrP重組蛋白的作用(圖6)。

圖6 補(bǔ)骨脂素緩解髓核細(xì)胞退變的機(jī)制Fig.6 The mechanism of psoralen alleviating the degeneration of HNPCs

綜上所述，本研究結(jié)果表明，補(bǔ)骨脂素可通過促進(jìn)SKP2介導(dǎo)的PTHrP蛋白泛素化降解，激活SIRT1通路，緩解炎癥環(huán)境下髓核細(xì)胞的退變。