包海藍 特日格樂 其木格

中圖分類號 R965 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）13-1578-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.13.07

摘 要 目的：研究紅花黃色素對慢性阻塞性肺疾?。–OPD）模型大鼠肺功能的改善作用。方法：將SD大鼠隨機分為對照組、模型組、陽性對照組（地塞米松，0.09 mg/kg）和紅花黃色素低、中、高劑量組（5、10、20 mg/kg），對照組10只大鼠，其余組各11只大鼠。除對照組外，其余各組大鼠以注射脂多糖聯(lián)合煙熏法復制COPD模型。造模成功后，對照組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，給藥組灌胃相應藥物，每天1次，連續(xù)12周。末次給藥后，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測大鼠血清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素（IL-6）、IL-8水平;采用血氣分析儀檢測全血中血氣指標[動脈氧分壓（PaO2）、血氧飽和度（SaO2）、動脈二氧化碳分壓（PaCO2）]水平;采用肺功能檢測儀檢測大鼠肺功能指標[肺活量（FVC）、1秒用力呼氣量（FEV1）、FEV1/FVC、最大呼氣量（PEF）、最大呼氣時中期流速（MMEF）]水平;采用Western blot法檢測大鼠肺組織中Toll樣受體4（TLR4）、核因子κB（NF-κB）、NF-κB抑制蛋白（IκBα）表達水平;采用蘇木精-伊紅染色法觀察大鼠肺組織的病理學形態(tài)變化。結果：與對照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-8水平，全血中PaCO2水平以及肺組織中TLR4、NF-κB蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01）;全血中PaO2、SaO2水平，肺功能指標FVC、FEV1、FEV1/FVC、PEF、MMEF水平以及肺組織中IκBα蛋白表達水平均顯著降低（P<0.01）;肺組織上皮細胞出現(xiàn)明顯的變性、壞死，細胞間質有明顯的炎性浸潤現(xiàn)象。與模型組比較，紅花黃色素各劑量組大鼠血清中炎癥因子水平、全血中血氣指標水平、肺功能指標水平及肺組織中相關蛋白的表達水平（低劑量組的IκBα除外）均顯著逆轉（P<0.05或P<0.01）;肺組織上皮細胞壞死、脫落、炎性浸潤等情況均不同程度地改善。結論：紅花黃色素能明顯改善COPD模型大鼠的肺功能;其作用機制可能與抑制炎癥因子表達，調控TLR4/NF-κB通路相關蛋白的表達有關。

關鍵詞 紅花黃色素;慢性阻塞性肺疾病;炎癥因子;Toll樣受體4;核因子κB

Improvement Effects of Safflower Yellow on Lung Function of Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model Rats

BAO Hailan1，Terigele2，Qimuge3（1. School of College of Mongolian Medicine， Inner Mongolia University for Nationalities， Inner Mongolia Tongliao 028000， China; 2. Network Center， Inner Mongolia University for Nationalities， Inner Mongolia Tongliao 028000， China; 3. Dept. of Mongolian Respiratory Medicine， the Affiliated Hospital of Inner Mongolia University for Nationalities， Inner Mongolia Tongliao 028000， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the improvement effects of safflower yellow on lung function in chronic obstructive pulmonary disease （COPD） model rats. METHODS： SD rats were randomly divided into control group， model group， positive control group （dexamethasone， 0.09 mg/kg）， safflower yellow low-dose， medium-dose and high-dose groups （5， 10， 20 mg/kg）， with 10 rats in control group and 11 rats in other groups. Except for control group， other groups were given lipopolysaccharide combined with fumigation to induce COPD model. After modeling， control group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically， and administration groups were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 12 weeks. After last medication， the levels of TNF-α， IL-6 and IL-8 were detected by ELISA. The levels of blood gas indexes （PaO2， SaO2 and PaCO2） in whole blood were detected by blood gas analyzer. The levels of lung function indexes （FVC， FEV1， FEV1/FVC， PEF and MMEF） were detected by lung function analyzer. The expression of TLR4， NF-κB and IκB-α protein were detected by Western blot. HE staining was used to observe the pathological changes of lung tissue. RESULTS： Compared with control group， the serum levels of TNF-α， IL-6 and IL-8， the level of PaCO2 in whole blood as well as the protein expression of TLR4 and NF-κB in lung tissue were increased significantly in model group （P<0.01）; the levels of PaO2 and SaO2 in whole blood， the levels of lung function as FVC， FEV1， FEV1/FVC， PEF and MMEF as well as the protein expression of? ? ?IκBα in lung tissue were decreased significantly （P<0.01）; there were obvious degeneration and necrosis in the epithelial cells of lung tissue， and obvious inflammatory infiltration in the interstitial cells. Compared with model group， the levels of inflammatory factors in serum， blood gas indexes in whole blood and lung function indexes as well as the expression of related protein in lung tissue （except for IκBα in low-dose group） were reversed significantly in safflower yellow groups （P<0.05 or P<0.01）; the necrosis， exfoliation and inflammatory infiltration of epithelial cells in lung tissue were improved in varying degrees. CONCLUSIONS： Safflower yellow can significantly improve the lung function of COPD model rats， and its mechanism may be related to inhibiting the expression of inflammatory factors and regulating the expression of TLR4/NF-κB pathway-related proteins.

KEYWORDS? ?Safflower yellow; Chronic obstructive pulmonary disease; Inflammatory factors; TLR4; NF-κB

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種具有氣流阻塞特征的慢性支氣管炎和（或）肺氣腫，主要表現(xiàn)為進行性的肺功能衰退及慢性炎癥反應[1-3]，且隨著其病程發(fā)展可能會導致動脈粥樣硬化、靜脈栓塞等多種并發(fā)癥[4-6]，極大程度地損害了患者的生命安全。因此，尋找能夠有效治療、改善COPD的用藥方案具有重要的臨床意義。近年來，隨著中醫(yī)藥產業(yè)的發(fā)展壯大，中藥在COPD方面的應用逐漸受到關注[7]。紅花黃色素是從中藥紅花中提取的一種天然色素，屬于查耳酮類化合物，具有降血壓、保護心血管、抗氧化、抗炎、抗癌等多種藥理作用[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，紅花黃色素對COPD具有一定的治療效果[10-12]，但其作用機制尚不清楚。

氣道內的炎癥反應是COPD的重要發(fā)病機制。COPD患者氣道內出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤，并產生大量腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）、IL-8等炎癥因子，對患者氣道造成損傷[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體4（TLR4）的激活可刺激NF-κB炎癥通路，引發(fā)一系列炎癥反應[14];且已有研究證明，TLR4/NF-κB通路在COPD患者體內被激活，并參與了其炎癥反應的發(fā)展進程[15]?；诖耍狙芯客ㄟ^構建COPD大鼠模型，研究紅花黃色素對COPD模型大鼠肺功能的改善作用及其對TLR4/NF-κB通路的影響，以期為COPD的臨床治療提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：ABL90型血氣分析儀（上海雷杜米特醫(yī)療設備有限公司）、SCIREQ型小動物肺功能檢測儀（北京廣源達科技發(fā)展有限公司）、MR-96A型酶標儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）、KL01A型離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）、FA2104型電子天平（上海恒平科學儀器有限公司）、DYCZ-40K型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用主要藥品與試劑包括：紅花黃色素對照品（南京道斯夫生物科技有限公司，批號78281-02-4，純度>98%），地塞米松片（廣東華南藥業(yè)集團有限公司，批號A14202002484，規(guī)格0.75 mg），脂多糖（美國Sigma公司，批號08168），TNF-α檢測酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒、IL-6 ELISA檢測試劑盒、IL-8 ELISA檢測試劑盒（南京建成生物科技有限公司，批號分別為H052 、H007、H008），BCA蛋白定量試劑盒（英國Abcam公司，批號ab102536），鼠源TLR4單克隆抗體、兔源NF-κB單克隆抗體、兔源核因子κB抑制蛋白（IκBα）單克隆抗體、鼠源β-actin單克隆抗體、山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗、山羊抗兔IgG二抗（英國Abcam公司，批號分別為ab22048、ab32536、ab32518、 ab8226、 ab205719、 ab205718）;其余試劑為實驗室常用規(guī)格，水為純凈水 。

1.3 動物

本研究所用動物為成年雄性SD大鼠，SPF級，體質量（200±20） g，購自武漢大學實驗動物中心，動物生產合格證號為 SCXK（鄂）2017-0004。 大鼠飼養(yǎng)于室溫20～25 ℃、相對濕度50%～60%的動物房內，通風良好。大鼠自由進食飲水，適應性喂養(yǎng)1周后進行后續(xù)實驗。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將大鼠分為對照組、模型組、地塞米松組（陽性對照，0.09 mg/kg，劑量參考文獻[16]設置）和紅花黃色素低、中、高劑量組（5、10、20 mg/kg，劑量參考文獻[17]設置），除對照組10只大鼠外，其余組各11只大鼠。參考文獻[18]方法，將除對照組之外的大鼠置于自制有機玻璃箱內，每日煙熏1 h，每次20支香煙，并于實驗開始后第7、14、21天向其氣管內注射脂多糖（1 mg/kg，注射當日不熏煙），持續(xù)8周，以復制COPD模型。造模結束后，除對照組外，其余各組分別取1只大鼠處死，剖取其肺組織，進行病理學變化觀察。當大鼠肺組織呈明顯的病理形態(tài)，且肺上皮細胞變性、壞死，細胞間隙伴有大量炎性細胞浸潤時，表明造模成功。造模成功后，對照組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，各給藥組大鼠灌胃相應藥物（臨用時以生理鹽水溶解），灌胃體積為10 mL/kg，每天1次，連續(xù)12天。

2.2 樣本采集

末次給藥后，各組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）進行麻醉，于腹腔主動脈取血適量，一部分經枸櫞酸鈉抗凝處理后直接保存，作為全血樣品;一部分以3 000 r/min離心10 min，取上清液，作為血清樣品。在測定肺功能指標水平后，處死各組大鼠，剖取其肺組織，一部分用于相關蛋白表達水平的檢測，一部分進行病理學觀察。

2.3 大鼠血清中炎癥因子水平的測定

取“2.2”項下各組大鼠血清樣品，按ELISA試劑盒說明書方法操作，采用酶標儀于450 nm波長下，測定血清中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8的水平。

2.4 大鼠全血中血氣相關指標水平的測定

取“2.2”項下各組大鼠全血樣品，使用血氣分析儀檢測相關血氣相關指標[動脈氧分壓（PaO2）、血氧飽和度（SaO2）、動脈二氧化碳分壓（PaCO2）]的水平。

2.5 大鼠肺功能指標水平的測定

各組大鼠取血后，采取仰臥位將其放置于肺功能檢測儀內，并進行氣管插管，然后記錄大鼠肺功能指標[肺活量（FVC）、1秒用力呼氣量（FEV1）、FEV1/FVC、最大呼氣量（PEF）、最大呼氣時中期流速（MMEF）]水平。

2.6 大鼠肺組織中TLR4/NF-κB通路相關蛋白表達水平的檢測

采用Western blot法進行檢測。取“2.2”項下各組大鼠肺組織，切取其右中葉部分的肺組織（距肺門3 mm處）適量，加入蛋白裂解液提取總蛋白，然后以12 000? ? r/min離心10 min，取上層蛋白液，以BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白經變性處理后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）;轉膜，以5%脫脂奶粉在室溫的條件下封閉1 h;以TBST清洗5 min×3次，加入TLR4、NF-κB、IκBα、β-actin一抗（稀釋度均為? ?1 ∶ 1 000），并于4 ℃條件下孵育過夜;以TBST清洗5 min×3次，加入相應二抗（稀釋度均為1 ∶ 5 000），于室溫條件下孵育1 h;以TBST清洗5 min×3次，加入ECL發(fā)光劑顯色后，置于全自動凝膠成像系統(tǒng)中成像。采用Image Pro Plus 6.0軟件分析圖像，以目的蛋白與內參β-actin的灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

2.7 大鼠肺組織的病理學形態(tài)觀察

取“2.2”項下各組大鼠肺組織，于10%甲醛溶液中固定3 天后，經石蠟包埋、切片（5 μm），再進行蘇木精-伊紅（HE）染色，然后于顯微鏡下觀察肺組織的病理學形態(tài)變化并拍照。

2.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析，首先采用方差齊性檢驗，將符合正態(tài)分布的計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 紅花黃色素對大鼠血清中炎癥因子水平的影響

與對照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-8水平均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，地塞米松組和紅花黃色素各劑量組大鼠血清中上述指標水平均顯著降低（P<0.01），詳見表1。

3.2 紅花黃色素對大鼠全血中血氣相關指標水平的影響

與對照組比較，模型組大鼠全血中PaO2、SaO2水平均顯著降低（P<0.01），PaCO2水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，地塞米松組和紅花黃色素各劑量組大鼠的PaO2、SaO2水平均顯著升高（P<0.01），PaCO2水平均顯著降低（P<0.01），詳見表2（表中，1 mmHg≈0.133 kPa）。

3.3 紅花黃色素對大鼠肺功能指標水平的影響

與對照組比較，模型組大鼠FVC、FEV1、FEV1/FVC、PEF、MMEF水平均顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，地塞米松組和紅花黃色素各劑量組大鼠上述指標水平均顯著升高（P<0.05或 P<0.01），詳見表3。

3.4 紅花黃色素對大鼠肺組織中TLR4/NF-κB通路相關蛋白表達水平的影響

與對照組比較，模型組大鼠肺組織中TLR4、NF-κB蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01），IκBα蛋白表達水平顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，地塞米松組和紅花黃色素各劑量組大鼠肺組織中TLR4、NF-κB蛋白表達水平均顯著降低（P<0.01），IκBα（紅花黃色素低劑量組除外）蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01），詳見圖1、表4。

3.5 紅花黃色素對大鼠肺組織病理學形態(tài)的影響

對照組大鼠肺組織結構完整，上皮細胞未出現(xiàn)壞死、脫落，細胞間質未發(fā)現(xiàn)炎性浸潤或組織增生等情況;模型組大鼠肺組織上皮細胞出現(xiàn)明顯的細胞變性、壞死，細胞間質有明顯的炎性浸潤現(xiàn)象;地塞米松組和紅花黃色素各劑量組大鼠肺組織上皮細胞壞死、脫落、炎性浸潤等情況均不同程度地改善，詳見圖2。

4 討論

COPD的發(fā)生與吸煙、過敏、感染等多種因素有關，但其具體發(fā)病機制尚不明確[4]。目前，大多數(shù)學者認為，可通過降低體內炎癥反應來抑制COPD的發(fā)展[19]。宋麗娟等[20]研究發(fā)現(xiàn)，紅花黃色素對急性肺損傷模型小鼠體內的炎癥反應有明顯的抑制作用，且能明顯抑制小鼠體內TLR4基因及蛋白的表達。TLR4是一類天然免疫受體，是NF-κB通路的上游信號分子，TLR4被激活后可進一步激活NF-κB通路，進而激活該通路的下游靶蛋白，引起一系列炎癥反應[14]。TNF-α、IL-6、IL-8均是常見的炎癥因子，其在COPD患者體內的水平均顯著升高，從而刺激氣道釋放黏液、促進炎癥反應，進而加重肺組織損傷[13]?；诖耍狙芯繑M探討紅花黃色素對COPD模型大鼠肺功能的改善作用及其對TLR4/NF-κB通路的影響。此外，因目前臨床治療COPD主要以地塞米松片為主，故本研究以其作為陽性對照藥進行研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，COPD模型大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-8水平均顯著升高;全血中PaO2、SaO2及肺功能指標FVC、FEV1、FEV1/FVC、PEF、MMEF水平均顯著降低，全血中PaCO2水平顯著升高;肺組織中TLR4、NF-κB蛋白表達水平均顯著升高，IκBα蛋白表達水平顯著降低;大鼠肺組織出現(xiàn)明顯病變及炎性浸潤。這提示COPD模型大鼠體內TLR4/NF-κB炎癥通路被激活，使大鼠體內炎癥反應加劇，同時損傷了大鼠的肺組織。但經紅花黃色素干預后顯示，大鼠血清中上述炎癥因子水平均顯著降低，肺功能指標水平和肺組織病變情況均得到明顯改善，且肺組織中TLR4、NF-κB蛋白表達水平均顯著降低，IκBα（紅花黃色素低劑量組除外）蛋白表達水平均顯著升高。由此說明，紅花黃色素可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路的表達，從而減少炎癥反應的發(fā)生，進一步抑制COPD模型大鼠的疾病發(fā)展進程，改善模型大鼠的肺功能水平。

綜上所述，紅花黃色素能明顯改善COPD模型大鼠的肺功能，其作用機制可能與抑制炎癥因子表達，調控TLR4/NF-κB通路相關蛋白的表達有關。

參考文獻

[ 1 ] GAO H X， SU Y， ZHANG A L，et al. MiR-34c-5p plays a protective role in chronic obstructive pulmonary disease via targeting CCL22[J]. Exp Lung Res，2019，45（1/2）：1-12.

[ 2 ] PANEVINA A S，SMETNEVA N S，VASILENKO A M，et al. The effects of menopausal hormone therapy on proinflammatory cytokines and immunoglobulins in perimenopausal patients with type 2 diabetes mellitus and chronic obstructive pulmonary disease （COPD）[J]. Ter Arkh，2018，90（10）：79-83.

[ 3 ] 陶陽，郭洪花，張彩虹.慢性阻塞性肺疾病相關性衰弱發(fā)病機制及營養(yǎng)干預的研究進展[J].中國全科醫(yī)學，2021，24（6）：684-689.

[ 4 ] 李洪曉，吳細英.老年哮喘-慢性阻塞性肺疾病重疊綜合征臨床特征及危險因素[J].中國老年學雜志，2019，39（21）：5264-5266.

[ 5 ] 朱曉敏，羅健，李苗苗，等.慢性阻塞性肺疾病患者并發(fā)靜脈血栓栓塞癥危險因素的Meta分析[J].中華護理雜志，2019，54（5）：746-752.

[ 6 ] 杜飛，張李，陳代剛，等.不同程度的慢性阻塞性肺疾病患者合并心血管疾病及其危險因素的比較[J].中國呼吸與危重監(jiān)護雜志，2017，16（4）：311-313.

[ 7 ] 劉淑玲，蔡海榮，陳燕虹，等.紅花黃色素對動脈粥樣硬化大鼠內皮功能、炎癥反應、氧化應激的影響[J].中國老年學雜志，2019，39（18）：4585-4588.

[ 8 ] 袁琴琴，劉文營.紅花生物活性成分及功能特性研究進展[J].食品工業(yè)科技，2020，41（3）：332-338，344.

[ 9 ] 馬嘉翼，褚松齡.羥基紅花黃色素A改善缺血性腦卒中機制的研究進展[J].中國現(xiàn)代應用藥學，2019，36（8）：1012-1017.

[10] 劉永剛，李芳君，湯芳.羥基紅花黃色素A對大鼠心肌細胞缺血再灌注損傷的保護作用[J].中藥藥理與臨床，2015，31（1）：71-74.

[11] 劉金連，王海芳，馬淑惠，等.羥基紅花黃色素A通過抑制動脈內皮細胞中TNFR1/NF-κB信號通路而發(fā)揮抗炎作用[J].細胞與分子免疫學雜志，2015，31（7）：945-948.

[12] 高峰，韋彬祥，盧肖芳.小劑量肝素鈉聯(lián)合紅花黃色素治療老年慢性阻塞性肺疾病急性加重期的臨床療效[J].臨床合理用藥雜志，2020，13（12）：1-2，5.

[13] 王會娟，王昌明，唐靈，等.慢性阻塞性肺疾病模型大鼠核因子κB及腫瘤壞死因子α、白細胞介素8的表達水平及其意義[J].廣西醫(yī)學，2020，42（5）：586-590.

[14] WANG X X，LUO B J，LU Y Y，et al. The triggering receptor expressed by myeloid cells-1 activates TLR4- MyD88-NF-κB-dependent signaling to aggravate ventilation-induced lung inflammation and injury in mice[J]. Cell Tissue Res，2018，374（1）：137-148.

[15] 封繼宏，祁海燕，李美鳳，等.扶正祛邪方對慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期模型大鼠肺組織細菌菌落的影響[J].中醫(yī)雜志，2016，57（4）：337-341.

[16] 薛曉明，王洋，趙勤萍，等.宣肺平喘膠囊對慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2017，23（2）：120-125.

[17] 張園，張妍.羥基紅花黃色素A對心肌缺血再灌注損傷大鼠血清炎性因子及心肌組織NF-κB表達的影響[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2020，18（16）：2603-2607.

[18] 王瑋，王琦，張永生，等.香煙聯(lián)合脂多糖建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型[J].中華中醫(yī)藥雜志，2018，33（9）：3866-3871.

[19] 黃園，李璐.丹紅注射液聯(lián)合低分子肝素對老年COPD患者的臨床癥狀、血清炎癥因子及肺功能的影響[J].中國藥房，2017，28（21）：2922-2925.

[20] 宋麗娟，朱煜，金鳴.羥基紅花黃色素A抑制脂多糖誘導的急性肺損傷小鼠炎癥因子表達的研究[J].中國呼吸與危重監(jiān)護雜志，2016，15（6）：577-582.

（收稿日期：2021-01-13 修回日期：2021-04-16）

（編輯：唐曉蓮）