李鳳蓮，王玉新，杜麗新，霍立剛，劉俊芳，桑梅香，李書清

(1.河北省衡水市第五人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 衡水 053000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心免疫室，河北 石家莊050011；3.河北省衡水市人民醫(yī)院，河北 衡水 053000)

0 引言

現(xiàn)今乳腺癌是國(guó)內(nèi)外女性的疾病殺手之一[1]，盡管治療手段多樣化[2]，其危害性依然強(qiáng)大。近年來(lái)，腫瘤相關(guān)抗原的研究已經(jīng)成為腫瘤免疫治療研究的熱點(diǎn)。作為癌/睪丸抗原家族成員之一的MAGE，由于其表達(dá)特性以及對(duì)腫瘤病理指標(biāo)變化的影響，為臨床免疫治療效果提供參考。本研究采用免疫組織化學(xué)法研究在乳腺癌組織及相應(yīng)乳腺正常組織中MAGE-A 家族 (包括 MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10和-A12，以下簡(jiǎn)稱為MAGE-As)的表達(dá)；分析了MAGE-As蛋白與乳腺癌患者的臨床病理學(xué)指標(biāo)之間的相關(guān)性，為臨床乳腺癌治療提供理論依據(jù)及參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇衡水市第五人民醫(yī)院2018年至2019年住院患者110名女性患者，患者診斷方法采用現(xiàn)今常用的經(jīng)典經(jīng)針吸細(xì)胞學(xué)或冰凍病理切片法，年齡34～76歲，其排除標(biāo)準(zhǔn)：未進(jìn)行化療、放療和內(nèi)分泌治療?；颊呋厩闆r：＜55歲者60例，≥55歲者50例 。腫瘤大?。骸? cm3的患者量為13例，＞5cm3的患者量為75例，在上述兩者之間的患者量為22例。根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟UICC的乳腺癌分期標(biāo)準(zhǔn)對(duì)乳腺癌患者進(jìn)行分期：I期，Ⅱ期，Ⅲ期的人數(shù)分別為24例，69例，17例；組織學(xué)分期，I，II級(jí)，Ⅲ級(jí)級(jí)患者數(shù)量依次為28例，68例，14例； ER呈陽(yáng)性及陰性患者分別有70例，40例； PR陽(yáng)性及陰性患者分別有69例，41例；臨床病理學(xué)檢測(cè)顯示： HER-2是陽(yáng)性(+++)47例，HER-2陰性(-)者63例； VEGF陽(yáng)性及陰性分別有99例，11例；抑癌基因P53陽(yáng)性者及PR陰性者依次為46例， 64例。腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者54例，腋淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移患者56例。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

乳腺癌組織的收集：離體半小時(shí)內(nèi)的新鮮的組織，正常乳腺組織的收集：距乳腺癌組織大于5 cm的福爾馬林溶液(10%)固定，石蠟包埋。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

采用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶法 (streptavidin peroxdase conjugated method，S-P)，試劑盒來(lái)源是北京中杉生物技術(shù)有限公司，操作步驟完全依照說(shuō)明書進(jìn)行。鼠抗人MAGE-A(6C1)單克隆抗體(Abcam公司)1:200稀釋。陽(yáng)性對(duì)照是人的正常睪丸組織，陰性對(duì)照是乳腺的正常組織。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析，采用卡方檢驗(yàn)及Spearsman檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 判定標(biāo)準(zhǔn)

將組織標(biāo)本放在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，隨機(jī)選取計(jì)數(shù)細(xì)胞大于2000個(gè)的高倍鏡視野20個(gè)，對(duì)這20個(gè)視野進(jìn)行綜合判斷分析，得出細(xì)胞陽(yáng)性率及其染色強(qiáng)度。

本實(shí)驗(yàn)的病理判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：MAGE-As的陽(yáng)性病理分級(jí)主要依據(jù)顯微觀察范圍內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞內(nèi)細(xì)顆粒顏色判斷。細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色細(xì)顆粒，陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目少于25%，標(biāo)記為MAGE-As(-)；陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目約26%～50%，細(xì)胞內(nèi)顆粒顏色呈淡黃色標(biāo)記為(+)；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)約51%～75%，細(xì)胞內(nèi)顆粒顏色呈棕黃色，標(biāo)記為(++)；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占76%-100%，細(xì)胞內(nèi)顆粒顏色呈棕色，以上為(+++)。

圖1 正常組織MAGE-As蛋白的表達(dá)(包含MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6、-A10、-A12)

圖2 正常組織MAGE-As蛋白的表達(dá)

圖3 MAGE-As 在乳腺癌組織中的陰性表達(dá)

圖4 MAGE-As 在乳腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)

2.2 MAGE-As在乳腺癌和相應(yīng)癌旁正常組織中的表達(dá)

研究表明：通過(guò)對(duì)110例患者的癌旁正常乳腺組織研究可知，所有正常乳腺組織均未發(fā)現(xiàn)MAGE-As的蛋白表達(dá)，有48例患者組織的MAGE-As蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性，即陽(yáng)性率為43.6%，結(jié)果提示MAGE-As是腫瘤特異性抗原，見(jiàn)表1。

表1 MAGE-As在乳腺癌和相應(yīng)癌旁正常組織中的表達(dá)

2.3 MAGE-As蛋白的表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理學(xué)指標(biāo)之間的相關(guān)性

見(jiàn)表2。

表2 MAGE-As蛋白表達(dá)與乳腺癌臨床病理學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性

在110例乳腺癌患者的組織中，HER-2表達(dá)陰性患者63 例 (-～++)，、陽(yáng)性患者 47 例 (+++)；MAGE-As表達(dá)陽(yáng)性的患者在HER-2表達(dá)陰性者中所占的比例為31.7%(20/63)；MAGE-As表達(dá)陽(yáng)性的患者在HER-2表達(dá)陽(yáng)性者中所占的比例為占61.7%(29/47)，明顯高于HER-2表達(dá)陰性組 (χ2=9.779，P=0.002)。MAGE-As蛋白的表達(dá)與 HER-2 及ER的表達(dá)呈正相關(guān)。

ER研究結(jié)果表明： ER表達(dá)呈陰性的患者有40例(-～++)，其中 MAGE-As表達(dá)呈陽(yáng)性占 35.0%(14/40)，ER 表達(dá)呈陽(yáng)性(+++)的患者有70例，其中MAGE-As表達(dá)呈陽(yáng)性的患者占57.1%(40/70)，明顯高于ER表達(dá)的陰性組(χ2=4.994，P=0.025)。

除此之外，MAGE-As蛋白的表達(dá)與乳腺癌患者的其它臨床參數(shù)均無(wú)明顯相關(guān)性 (P＞0.05)，如 VEGF(χ2=0.565，P=0.331)，P53(χ2=0.659，P=0.417)、乳腺癌患者年齡 (χ2=1.509，P=0.219)，PR 狀態(tài) (χ2=1.182，P=0.0277)、臨床分期 (χ2=4.885，P=0.087)、腫瘤大小 (χ2=7.648，P=0.122)、組織學(xué)分級(jí) (χ2=5.96，P=0.051)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 (χ2=0.044，P=0.835)。

3 討論

乳腺癌屬于異質(zhì)性疾病中的一種，是女性最常見(jiàn)且最恐懼的惡性腫瘤之一。乳腺癌的發(fā)生與多種因素有關(guān)，如年齡、避孕藥、飲酒、焦慮、病毒感染等因素，針對(duì)乳腺癌形成可能有關(guān)的因素，結(jié)合腫瘤免疫學(xué)和分子生物學(xué)的綜合研究，現(xiàn)今最乳腺癌進(jìn)行治療的方法主要是以腫瘤特異性抗原為基礎(chǔ)的進(jìn)行的治療，該治療方法具有無(wú)創(chuàng)傷、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。對(duì)一些復(fù)發(fā)、晚期和轉(zhuǎn)移腫瘤具有較好的療效。

MAGE-A家族成員存在同源結(jié)構(gòu)域，制備對(duì)MAGE-A家族所有成員都起作用的特異性的抗體難以實(shí)現(xiàn)，因此限制了該家族成員蛋白水平的研究[3,4]。本研究利用MAGEA(6C1)抗體，由于其可與MAGE-As發(fā)生交叉反應(yīng)，可同時(shí)檢測(cè)。乳腺癌組織及其癌旁正常組織中的MAGE-As蛋白的表達(dá)研究表明：MAGE-As蛋白在110例乳腺癌組織中陽(yáng)性率為43.6%(P＜0.05)，MAGE-As蛋白在非乳腺癌的正常組織不表達(dá)，說(shuō)明MAGE-As蛋白是乳腺癌組織的特異性抗原。

MAGE-As蛋白表達(dá)與乳腺癌患者臨床一般特征(包含年齡、VEGF、腫瘤大小、PR狀態(tài)、淋巴轉(zhuǎn)移、病理類型、P53、臨床分期、組織學(xué)分級(jí)等)研究表明：兩者均無(wú)顯著關(guān)系。乳腺癌患者中HER-2呈陽(yáng)性者M(jìn)AGE-As的表達(dá)率61.7%(29/47)，明顯高于 HER-2 呈陰性組 41.3%(26/63)(χ2=9.779，P=0.002)，該統(tǒng)計(jì)結(jié)果可得出以下結(jié)論：MAGE-As與HER-2具有相關(guān)性，并且是呈正相關(guān)。Kufer等人研究顯示[5,6,7]HER-2的表達(dá)呈陽(yáng)性會(huì)對(duì)乳腺癌患者的預(yù)后產(chǎn)生不良影響，MAGE-As與HER-2又是呈彼高此高的正相關(guān)，分析MAGE-As蛋白的高表達(dá)同樣對(duì)乳腺癌患者的預(yù)后產(chǎn)生不良影響，可能是其預(yù)后不良的重要標(biāo)志。

分析ER陽(yáng)性的乳腺癌患者M(jìn)AGE-As蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，此類患者M(jìn)AGE-As蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為57.1%(40/70)，明 顯 高 于 ER 陰 性 患 者 35.0%(14/40)(χ2=4.994，P=0.025)。MAGE-As蛋白在乳腺癌組織中高表達(dá)可推測(cè)MAGE-As蛋白可作為乳腺癌治療的參考指標(biāo)之一。

重組蛋白MAGE可作為免疫原產(chǎn)生的抗體，可與MAGE-A12、MAGE-A1-A4，MAGE -A10、MAGE-A6發(fā) 生 反 應(yīng)，推測(cè)可研究MAGE-As的多價(jià)疫苗。另外，腫瘤中抗原表位的呈遞具有HLA型別的限制，CTA的表達(dá)不均質(zhì)，僅僅應(yīng)用CTA免疫療法不理想，應(yīng)該依據(jù)受體患者及腫瘤個(gè)體特異性，設(shè)計(jì)包含多類型表位的CTA多價(jià)疫苗。