莫彩蓮，李杰，王加珍，劉鑫，林圣華，牟艷玲， 張云，劉可春*，何秋霞*

(1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 山東省科學(xué)院生物研究所 山東省人類疾病斑馬魚模型與藥物篩選工程技術(shù)研究中心， 山東 濟南 250014; 2.山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院) 藥物研究所，山東 濟南 250062)

血栓性疾病具有高發(fā)病率、高致殘率和高致死率，嚴(yán)重威脅著人類的健康[1]。在血栓性疾病的研究過程中，已經(jīng)建立了許多動物血栓模型。兔、犬、貓、小型豬動物血栓模型存在實驗成本高、飼養(yǎng)空間占有率大、對動物創(chuàng)傷大和術(shù)后管理困難等問題，易導(dǎo)致非血栓性死亡。大鼠、小鼠動物血栓模型由于其體型較小，操作技術(shù)要求高，且在建造某些血栓模型中血栓形成率低，不穩(wěn)定，存在形成的血栓易溶栓等問題。傳統(tǒng)的動物血栓模型雖然已經(jīng)研究多年，但誘導(dǎo)形成的動物血栓模型與人類病理性血栓還存在很多差異。因此建立與臨床病理生理機制相似的血栓模型對于抗栓藥物的研究是十分必要的[2]。

斑馬魚(Daniorerio)因其胚胎小、水生環(huán)境和小分子滲透性強等特點，成為一個備受青睞的用于高通量藥物篩選的模式動物。與線蟲、果蠅、鼠等其他模式生物相比，斑馬魚與人器官在結(jié)構(gòu)、生理、分子水平等方面驚人地相似，和人類的基因組保守性很高，基因組同源性87%。在蛋白質(zhì)水平上，關(guān)鍵部位的同源性幾乎是100%。斑馬魚血液對凝血劑(如膠原和ADP)和抗凝血劑(如阿司匹林和殺鼠靈warfarin)的反應(yīng)與人類血液相似，在人類血栓癥中起重要作用的幾個基因已經(jīng)通過序列同源性在斑馬魚中找到[3-5]。國內(nèi)外利用斑馬魚以及其突變體已建立了多種人類疾病模型，如抗新生血管形成、腫瘤、血液疾病、細(xì)胞凋亡和增殖、脂質(zhì)代謝、炎癥和中樞耐受等[6-7]，并開展了相關(guān)的藥物篩選評價研究工作。

在血栓形成過程中起核心作用的是血小板的活化。血小板是一種多功能細(xì)胞，具有黏附、聚集和釋放功能，并且有較強的促凝活性，在血栓形成與止血過程中起重要作用。許多血栓性疾病都有血小板聚集釋放功能亢進，微循環(huán)血小板聚集增多現(xiàn)象。抑制血小板聚集性的異常發(fā)生，對心腦血管性疾病及其他血栓栓塞性疾病的防治都有重要的意義[8]。我國擁有極為豐富的中藥材資源，從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎、活性獨特的先導(dǎo)化合物已經(jīng)成為新藥研究的一個重要途徑。本研究在建立斑馬魚血栓模型中，選擇20種中藥成分單體，分別利用斑馬魚模型和血小板模型檢測其對血小板聚集的影響，研究了斑馬魚模型在中藥成分活性評價中的適用性。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

中藥對照品葛根素(批號20051322，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%)、甘草次酸(批號18121241，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、銀杏內(nèi)酯A(批號19062716，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%)、銀杏內(nèi)酯B(批號19032631，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%)、桃葉珊瑚苷(批號19010241，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、姜黃素(批號19072423，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、苦參堿(批號19072636，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、金絲桃苷(批號19062525，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、紅景天苷(批號20070222、質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、綠原酸(批號20031535，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、虎杖苷(批號19080241，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%)、甘草苷(批號19041032，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、莽草酸(批號19071935，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、銀杏內(nèi)酯C(批號19112641，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%)、黃芪甲苷(批號19091023，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、芍藥苷(批號19071131，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、大豆苷元(批號20022611，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%)、大豆苷(批號20040906，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%)、防己諾林堿(批號20070344，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%)、鹽酸黃連堿(批號19042341，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)，均購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司；低分子肝素購自Sigma公司；二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)購自上海生工生物工程服務(wù)有限公司；三氯化鐵購自天津化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器

COIC-ZSA302 型體視顯微鏡；X51 型倒置顯微鏡；SZX16 型體視熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；PACKS-4 型血小板聚集儀(美國Helena公司)。

1.3 動物

野生型AB 系斑馬魚和TG系( integrin αIIb∶EGFP)血小板標(biāo)記綠色熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚均由本實驗室提供；清潔級SD雄性大鼠，體重(250±20)g，山東省中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號SCXK-(魯)-2019-0001。

2 方法

2.1 斑馬魚胚胎收集

2.2 樣品溶液配制

2.2.1 中藥對照品

稱取中藥對照品，溶于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中獲得100 mg/mL 樣品儲存液，再用胚胎培養(yǎng)用水稀釋至不同質(zhì)量濃度，并保證篩選體系中DMSO 體積分?jǐn)?shù)不高于 0.5%[9]。

2.2.2 三氯化鐵

用純凈水配成100 mg/L儲存液，用斑馬魚胚胎培養(yǎng)用水稀釋成不同濃度的三氯化鐵應(yīng)用溶液。

2.3 中藥對照品處理方法

斑馬魚受精發(fā)育天數(shù)(days post fertilization，dpf)為4 d時，在體視倒置顯微鏡下挑選發(fā)育正常的斑馬魚仔魚，移入24 孔板的樣孔中，每孔5條。樣孔中已預(yù)先加入新配好的中藥對照品溶液 (10、20、40 μg/mL)，對照組為胚胎培養(yǎng)用水，隨后加蓋封閉，置于光照培養(yǎng)箱(28 ℃)內(nèi)，讓胚胎繼續(xù)發(fā)育。

2.4 血栓形成檢測

斑馬魚血栓細(xì)胞在3 dpf開始進入循環(huán)系統(tǒng)，到5 dpf發(fā)育成熟。4 dpf斑馬魚仔魚經(jīng)受試藥品孵育24 h后，向各組加入2×10-6mol/L的三氯化鐵，并開始計時，在熒光顯微鏡下觀察TG熒光斑馬魚腸下腹主動脈血小板凝集，在倒置顯微鏡下觀察記錄腸下腹主動脈血管阻塞時間。

2.5 血小板血漿制備

2.6 抗血小板聚集體外實驗

將中藥單體按終濃度的10倍配制后，取20 μL 溶液加入含PRP 180 μL 管中，置于37 ℃ 孵育2 min。由PPP 調(diào)零后，用微量進液器在不同比色杯中加入20 μL二磷酸腺苷(ADP)，按比濁法[11]用血液聚集儀記錄5 min內(nèi)的聚集曲線，用聚集曲線面積來表示體外血小板的最大聚集率，并計算中藥單體抑制血小板聚集的聚集抑制率。聚集抑制率=(對照管最大聚集率-實驗管最大聚集率)÷對照管最大聚集率×100%。

2.7 統(tǒng)計分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，對照組與加藥組之間的比較用One-Way ANOVA分析，數(shù)據(jù)均以x±s表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 中藥材單體成分對斑馬魚血栓形成的影響

以5 dpf斑馬魚仔魚為模型，以三氯化鐵為血栓形成誘導(dǎo)劑，對20種中藥材單體成分進行了抗血栓形成活性檢測，結(jié)果顯示其中7種中藥材具有抑制血栓形成活性。桃葉珊瑚苷10 μg/mL具有明顯的抑制斑馬魚血栓形成作用，40 μg/mL處理組的血流時間超過了2 h。在銀杏內(nèi)酯B 20 μg/mL和40 μg/mL處理組，三氯化鐵誘導(dǎo)后的血流時間分別為(51.7±8.3)min和(69.5±9.7)min。黃芪甲苷、芍藥苷、甘草次酸、銀杏內(nèi)酯A和葛根素也表現(xiàn)出了不同程度的血栓形成抑制作用(表1)。

表1 中藥材單體成分對斑馬魚血栓形成的抑制作用(x ± s，n=30)

3.2 中藥單體成分對血小板體外聚集的影響

以離體血小板為模型，對上述20種中藥材成分進行了血小板聚集實驗，結(jié)果顯示12種中藥材成分具有抑制血小板聚集的作用，其中100 μg/mL 紅景天苷的血小板聚集抑制率為88.22%，100 μg/mL苦參堿抑制率為64.54%，25 μg/mL銀杏內(nèi)酯B抑制率為30.70%，50 μg/mL黃芪甲苷抑制率為53.91%，25 μg/mL 桃葉珊瑚苷抑制率39.71%，100 μg/mL 金絲桃苷抑制率為88.68%，50 μg/mL 芍藥苷抑制率為26.77%，50 μg/mL 大豆苷元抑制率為27.14%，50 μg/mL甘草次酸抑制率為59.57%，50 μg/mL 大豆苷抑制率為30.83%，50 μg/mL銀杏內(nèi)酯A抑制率為30.23%，25 μg/mL 葛根素抑制率為64.31%(表2)。

表2 中藥材單體成分對血小板聚集的影響(n=10)

基于斑馬魚模型抗血栓實驗和體外抗血小板聚集的實驗結(jié)果，我們查閱文獻發(fā)現(xiàn)(表3)，姜黃素[12]沒有體外血小板抗凝作用。與本研究結(jié)果一致。綠原酸[13]、甘草苷[14]、莽草酸[15]和銀杏內(nèi)酯C[16]、甘草次酸[17]、銀杏內(nèi)酯A[18]、桃葉珊瑚苷[19]對體外血小板聚集有抑制作用；虎杖苷[20]、苦參堿[21]和葛根素[22]可以抑制血小板聚集和微血栓的形成；銀杏內(nèi)酯B[23]、金絲桃苷[24-25]和紅景天苷[26]已被證實具有體外抗血小板凝聚活性和體內(nèi)抗血栓作用；芍藥苷[27]、黃芪甲苷[28]、大豆苷元和大豆苷[29]等單體中藥成分，未見在其他動物血栓模型上具有活性作用的單獨文獻報道，但都作為某些有效抗血栓藥物或抑制血小板聚集藥物成分一并報道過。本研究實驗結(jié)果與已有文獻報道結(jié)果基本一致，但某些中藥單體成分抗血栓形成活性不一致，其可能原因是采取的中藥成分單體用量以及采用的實驗方法不同所致。

表3 中藥材單體成分抗血栓形成活性對比表

續(xù)表3

4 結(jié)語

本研究利用斑馬魚血栓模型，對多種中藥活性單體成分同時進行抗血栓活性檢測，較其他傳統(tǒng)動物血栓模型用藥微量、高效，能夠高通量篩選抗栓活性成分。篩選出的活性成分通過血小板體外聚集實驗驗證以及查閱文獻比對，說明斑馬魚血栓模型對抗栓藥物的篩選有很好的適用性，這為發(fā)現(xiàn)抗血栓中藥活性單體提供了一個研究思路，為制造抗血栓藥物提供了可行的研究切入點。

下一步工作可以結(jié)合已報道的文獻，對篩選出的抗血栓中藥活性單體進行作用機制探索。