羅曦，李帥男，包永睿,3,4，王帥,3,4，李天嬌,3,4，孟憲生,3,4

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.沈陽市第二中醫(yī)院，遼寧 沈陽 110101；3.遼寧省中藥多維分析專業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116600；4.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連 116600)

近年來，結(jié)腸癌發(fā)病率持續(xù)增長，現(xiàn)已位居消化道惡性腫瘤第2位[1-2]。手術(shù)結(jié)合放化療是治療結(jié)腸癌的臨床主要手段，但其副作用大、患者易復(fù)發(fā)[3]。機(jī)體免疫系統(tǒng)在調(diào)節(jié)腫瘤免疫應(yīng)答，改變腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用，而大多數(shù)腫瘤細(xì)胞因機(jī)體免疫功能低下會逃逸免疫監(jiān)控，表現(xiàn)出“免疫逃逸”的現(xiàn)象是導(dǎo)致放化療后腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因[4]。腫瘤炎癥微環(huán)境屬中醫(yī)微觀辨證的范疇，應(yīng)在中醫(yī)傳統(tǒng)辨證理論的指導(dǎo)下，注重“溫補(bǔ)通滯”治法對腫瘤炎癥微環(huán)境的免疫調(diào)節(jié)作用[5]。枳殼為蕓香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培變種的干燥未成熟果實，歸脾、胃經(jīng)，具有理氣寬中、行滯消脹的功效[6]，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性[7]，作為理氣藥常出現(xiàn)于中醫(yī)臨床治療結(jié)腸癌的處方中[8-10]。枳殼揮發(fā)油為中藥枳殼的主要藥效成分之一，是其理氣健脾作用的基礎(chǔ)[11]?，F(xiàn)代研究表明，具有健脾功效的中藥，大多具有免疫調(diào)節(jié)作用[12-14]，然而，枳殼揮發(fā)油是否通過調(diào)控機(jī)體腫瘤炎癥微環(huán)境及免疫調(diào)節(jié)功能而發(fā)揮治療作用，目前未有報道。本研究采用氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉(AOM/DSS)建立小鼠炎癥相關(guān)結(jié)腸癌模型，探究枳殼揮發(fā)油對炎癥相關(guān)結(jié)腸癌小鼠腫瘤生長、免疫調(diào)節(jié)的影響及其可能機(jī)制，以期為枳殼揮發(fā)油的臨床應(yīng)用提供更多的藥效研究基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物與飼養(yǎng)條件 BALB/c小鼠均為雌性，體重(20±2)g，4 周齡，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)2020-0001；實驗單位使用許可證號：SYXK(遼)2013-0009。動物實驗室室溫22 ℃，濕度(50%±20%)，12 h/12 h明暗周期的環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水，適應(yīng)1周后用于實驗。

1.2 藥品與試劑 枳殼藥材(亳州市康美中藥有限公司，批號：20200716，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)許亮教授鑒定為蕓香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培變種的干燥未成熟果實)；氧化偶氮甲烷(Aladdin公司，批號：A1908142，純度95%)；葡聚糖硫酸鈉(Meilunbio公司，批號：S0925A)；TransZol Up，Trans-Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix，2×TransStart Top/Tip Green qPCR SuperMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。

1.3 實驗儀器 Thermal Cycler 5100實時熒光定量PCR儀(Thermo Fisher)。

2 實驗方法

2.1 枳殼揮發(fā)油藥液的制備 取枳殼藥材粉末(過2號篩)100 g，加水800 mL，保持微沸5 h，至測定器中揮發(fā)油量不再增加，停止加熱，放置1 h以上[6]。取揮發(fā)油適量，加2 % 吐溫-80溶液制成濃度為18.45 μL·mL-1的溶液，備用。

2.2 動物分組與模型制備 實驗動物隨機(jī)分成空白對照組、模型組、枳殼揮發(fā)油組，每組8只。除空白對照組外，其余組小鼠均按10 mg·kg-1的劑量腹腔注射AOM，每周1次，連續(xù)3周[15]；7 d后給予2.5% DSS的水溶液連續(xù)飲用3 d，之后給予三級水連續(xù)飲用5 d，8 d為1個周期，重復(fù)上述步驟4次?？瞻讓φ战M采用等體積0.9%氯化鈉注射液。從第1次DSS誘導(dǎo)時開始按照分組進(jìn)行藥物干預(yù)，按體重10 mL·kg-1給予制備好的灌胃用藥液，空白對照組和模型組給予等量0.9%氯化鈉注射液，連續(xù)4周，每天1次。

2.3 指標(biāo)檢測 觀察各組小鼠的營養(yǎng)狀況、體質(zhì)量和大便性狀等。實驗結(jié)束后，禁食24 h，以頸椎脫臼處死動物，取盲腸至直腸末端的全結(jié)腸組織。將結(jié)腸組織縱向剖開，沖洗內(nèi)容物，黏膜面朝上平鋪，觀察記錄有無腫瘤發(fā)生及發(fā)生數(shù)目、大小和位置，計算腫瘤發(fā)生率。取結(jié)腸組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h后，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，鏡下觀察。

2.4 定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

2.4.1 引物設(shè)計 GAPDH的上游引物：5′-GCCACCCAGAAGACTGTGGAT-3′，下游引物：5′- GGAAGGCCATGCCAGTGA-3′；Jagged-1的上游引物：5′-TGAAATACACGTGGCCATCTCT-3′，下游引物：5′- ACGCCTCTGAACTCTGACTTCTG-3′；Notch-1的上游引物：5′-ACTTGGCAGATGAACTTGCTCTT-3′，下游引物 5′- TGACCAGCTTGGAGTTTGCA-3′；Hes-1的上游引物：5′-TCCAAGCTAGAGAAGGCAGACAT-3′，下游引物：5′-GGGTCACCTCGTTCATGCA-3′；NF-κB-1的上游引物：5′-GCTCAGCTT GTGAGGGATCTG-3′，下游引物：5′- CCCAACCCTCAGCAAATCCT-3′；IL-1a的上游引物：5′-GATGAAGCTCGTCAGGCAGAA-3′，下游引物：5′-CCTCCCGACGAGTAGTAGGCATA-3′；PD-L1的上游引物：5′-GCGAATCACGCTGAAAGTCA-3′，下游引物：5′-ACGGGTTGGTGGTCACTGTT-3′；PD-1的上游引物：5′-TTCACCTGCAGCTTGTCCAA-3′，下游引物：5′-GGGCAGCTGTATGATCTGGAA-3′(Invitrogen生物試劑公司)。

2.4.2 各組小鼠結(jié)腸組織總RNA的提取

2.4.2.1 RNA 沉淀 稱取0.1 g組織加入1 mL Trizol up裂解液，在冰上研磨至無明顯顆粒，吸出轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，靜置10 min后，2 000 r·min-1，離心5 min；取上清液加入200 μL 氯仿，渦旋30 s ，靜置 5 min，12 000 r·min-1，4 ℃離心10 min。小心吸取頂層上清液轉(zhuǎn)移至另一EP管中，加入等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置10 min，12 000 r·min-1離心10 min。

2.4.2.2 RNA洗滌 離心后棄去異丙醇，加入預(yù)冷的75% 乙醇(DEPC水配制)洗滌RNA，靜置5 min，7 500 r·min-1，4 ℃離心5 min，離心后棄去乙醇，7 500 r·min-1，4 ℃離心5 min，小心吸出上一步殘留的乙醇，室溫干燥RNA。

2.4.2.3 總RNA純度及濃度測定 待RNA變?yōu)橥该鲿r，加入適量DEPC水溶解。測定A260/280，在1.6～2.0范圍內(nèi)，說明提取的總RNA純度較高，可以進(jìn)行后續(xù)實驗。測定RNA濃度，并將其稀釋調(diào)整到50 ng·μL-1的濃度，RNA樣品放-80 ℃保存。

2.4.3 RNA的逆轉(zhuǎn)錄 按照試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成，cDNA反應(yīng)體系20 μL，包括：Oligo(dT)18Primer(0.5 μg·μL-1)：1 μL，2 × TS Reaction Mix：10 μL，TransScript TM RT/RI Enzyme Mix：1 μL，gDNA Remover：1 μL。總RNA：4 μL，加入RNase Free Water至20 μL。反應(yīng)條件：25 ℃孵育15 min使引物和模板充分結(jié)合，42 ℃孵育15 min使逆轉(zhuǎn)錄酶發(fā)揮逆轉(zhuǎn)錄活性，85 ℃加熱5 s失活后置入4 ℃保存[16]。

2.4.4 Q-PCR 過程 使用實時熒光定量Thermal Cycler 5100 實時熒光定量PCR 儀，反應(yīng)體系為20 μL，低溫操作上述逆轉(zhuǎn)錄出的cDNA為模板進(jìn)行目的基因擴(kuò)增[17]。擴(kuò)增程序為：94 ℃ 30 s，(94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s)×40個循環(huán)。RealTime 反應(yīng)體系為：2×TransStart Top/Tip Green qPCR SuperMix：10 μL，上游引物(10 μmol·L-1)：0.4 μL，上游引物(10 μmol·L-1)：0.4 μL。cDNA 模板：1.6 μL，加入Nuclease-free Water至20 μL。每個樣品設(shè)置5個復(fù)孔，結(jié)果經(jīng)內(nèi)參均一化處理后，通過相對Ct值法計算Jagged-1、Notch-1、Hes-1、NF-κB-1、IL-1a、PD-L1和 PD-1 mRNA 相對表達(dá)水平，以GAPDH 為內(nèi)參基因，模型組的2-(ΔΔCt)定義為 1，其中 ΔCt=Ct目的基因- Ct內(nèi)參基因[18]。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用獨(dú)立t檢驗進(jìn)行分析，認(rèn)為P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 枳殼揮發(fā)油對小鼠體重的影響 與空白對照組對比，模型組小鼠在造模之后體重出現(xiàn)顯著下降(P<0.01)，枳殼揮發(fā)油組與模型組相比體重下降情況有所緩解(見圖1)。

圖1 各組小鼠體重變化趨勢

3.2 枳殼揮發(fā)油對小鼠空白對照狀態(tài)的影響 實驗?zāi)┢?，模型組小鼠出現(xiàn)厭食、脫毛、血便等表現(xiàn)，其中有2只小鼠伴有腹水(見圖2)，有一只小鼠死亡。枳殼揮發(fā)油組小鼠一般情況和營養(yǎng)狀況優(yōu)于模型組小鼠，沒有腹水情況。

圖2 AOM/DSS誘導(dǎo)的模型組小鼠血便(A)及腹水(B)發(fā)生情況

3.3 枳殼揮發(fā)油對結(jié)腸腫瘤個數(shù)影響 空白對照組小鼠腸黏膜表面光滑，其余各組均出現(xiàn)不同程度的增厚。腫瘤發(fā)生在小腸內(nèi)壁的黏膜上，主要分布在距肛門6 cm以內(nèi)腸段，3 cm以內(nèi)較為密集。呈蕈傘樣向腸內(nèi)腔突起(見圖3)。各組小鼠腫瘤發(fā)生數(shù)量(見表1)。與模型組相比，枳殼揮發(fā)油可顯著減少由AOM/DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸腫瘤發(fā)生數(shù)量(P<0.01)。

A.空白對照組；B.模型組；C.枳殼揮發(fā)油組

表1 各組小鼠結(jié)腸腫瘤發(fā)生數(shù)量

3.4 結(jié)腸組織HE染色病理切片 各組小鼠結(jié)腸組織病理切片(見圖4)。模型組小鼠結(jié)腸組織中細(xì)胞排列紊亂，腺管結(jié)構(gòu)消失，核增大；空白對照組小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞排列整齊，腺管清晰，核質(zhì)比正常；枳殼揮發(fā)油組結(jié)腸組織相對于模型組細(xì)胞紊亂程度呈現(xiàn)不同程度的減輕，腺管逐漸清晰，核質(zhì)比逐漸趨于正常，接近于空白對照組小鼠結(jié)腸組織。

A.空白對照組；B.模型組；C.枳殼揮發(fā)油組

3.5 各組小鼠結(jié)腸組織中的mRNA相對表達(dá)水平 各組小鼠結(jié)腸組織樣品中Jagged-1、Notch-1、Hes-1、NF-κB-1、IL-1a、PD-L1和 PD-1 mRNA的相對表達(dá)量結(jié)果見圖5。枳殼揮發(fā)油組小鼠結(jié)腸組織，Jagged-1、Notch-1、Hes-1、NF-κB-1、IL-1a、PD-L1和 PD-1 mRNA水平較模型組顯著降低(P<0.01)。

圖5 各組小鼠結(jié)腸組織中的mRNA相對表達(dá)

4 討論

近年來大量研究表明，Jagged 1/Notch信號通路在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)異常。Jagged 1是Notch受體的配體，其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且增加腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的可能性[19]。Notch與Jagged 1發(fā)生受體配體結(jié)合后，Notch 信號通路即被激活[20]。Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與調(diào)節(jié)腸發(fā)育和腸上皮更新，其異常激活與結(jié)直腸癌的發(fā)生有關(guān)[21]。

Notch與腫瘤的關(guān)系最早是在T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病中被發(fā)現(xiàn)，并被鑒定為致癌基因。在結(jié)腸癌相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)Notch信號通路中的Notch l受體在轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)腫瘤發(fā)生的信號中是必需的。Hes 1為Notch 信號途徑的重要受體及下游靶基因，激活 Notch 信號，在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)遠(yuǎn)高于癌旁組織[22]。在Notch信號通路中的眾多靶標(biāo)中，NF-κB是最重要的一個[23]，NF-κB家族的轉(zhuǎn)錄因子可以通過結(jié)合啟動子和增強(qiáng)子中不連續(xù)的DNA序列來誘導(dǎo)或抑制基因表達(dá)，參與細(xì)胞凋亡、周期等過程導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[24]。NF-κB轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)直腸癌組織中存在異常激活[25]，是參與結(jié)腸癌起始、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵介質(zhì)。NF-κB在免疫、炎癥和癌癥進(jìn)展等方面具有重要作用，在PD-L1啟動子的近端區(qū)域存在兩個NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)，NF-κB的激活增加，伴有PD-L1和促炎細(xì)胞因子IL-1表達(dá)的增加[26-29]。IL-1具免疫調(diào)節(jié)作用，可刺激多種免疫和炎癥應(yīng)答細(xì)胞[30]；程序性死亡受體1(PD-1)及其配體(PD-L1)與腫瘤細(xì)胞免疫“逃逸”相關(guān)，結(jié)腸癌組織中的 PD-L1表達(dá)明顯高于癌旁正常組織[31]。

本研究結(jié)果顯示，枳殼揮發(fā)油可顯著下調(diào)炎癥相關(guān)結(jié)腸癌小鼠結(jié)腸組織中 Jagged-1、Notch-1、Hes-1、NF-κB-1、IL-1a、PD-L1和 PD-1 mRNA水平，提示，枳殼揮發(fā)油具有調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)結(jié)腸癌小鼠腫瘤炎癥微環(huán)境及免疫調(diào)節(jié)的作用，其作用機(jī)制可能與Jagged 1-Notch/NF-κB/PD-L1信號通路有關(guān)(見圖6)。然而，枳殼揮發(fā)油具有多種藥理作用，其是否還通過其他途徑發(fā)揮治療炎癥相關(guān)結(jié)腸腫瘤的作用還需進(jìn)一步深入研究。

圖6 枳殼揮發(fā)油調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)結(jié)腸癌小鼠Jagged 1-Notch/NF-κB/PD-L1信號通路