趙輝，趙偉，李素霞，王衛(wèi)華，于淼

(1．菏澤醫(yī)學(xué)專科學(xué)校，山東 菏澤 274000；2．菏澤市立醫(yī)院，山東 菏澤 274013)

近年來缺血性腦卒中的發(fā)病率越來越高，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康，腦缺血再灌注后繼發(fā)性損傷對該類疾病的進(jìn)展有著較大的影響，細(xì)胞凋亡是腦缺血再灌注后繼發(fā)性損傷的主要原因[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，熱休克蛋白(Hsp-70)、凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bax)與細(xì)胞凋亡有著密切的關(guān)系。腦缺血前給予藥物預(yù)處理，在一定程度上可以減輕缺血再灌注損傷。丹皮酚是中藥牡丹皮的主要活性成分，除了具有抗癌、保肝、神經(jīng)保護(hù)、抗菌消炎、保護(hù)心血管等作用外，還具有腦保護(hù)作用[3]，但其作用機(jī)制尚無定論。本實(shí)驗(yàn)通過頸外動(dòng)脈線栓法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，以藥物預(yù)處理為出發(fā)點(diǎn)，觀察丹皮酚對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，為臨床上預(yù)防和治療缺血性腦卒中提供理論依據(jù)和治療思路。

1 材料

1.1 儀器 電熱恒溫水浴鍋(DK-S26型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；自動(dòng)雙重純水蒸餾儀(德SZ-93型，重慶光學(xué)儀器廠)；電子天平(BS 110S X型)、電子pH計(jì)(DELTA 320型)(德國Mettler Toledo公司)；DC200圖像采集系統(tǒng)、Image-proplus5.0醫(yī)學(xué)圖像分析軟件、光學(xué)顯微鏡、包埋機(jī)、切片機(jī)(德國Leica公司)；柯達(dá)圖像分析系統(tǒng)(美國柯達(dá)公司)；低溫高速離心機(jī)(美國BeekmanCoulter公司)。

1.2 藥品與試劑 丹皮酚注射液(上海第一生化藥業(yè)公司，批號：171201)；氯化三苯基四氮唑(TTC)、原位細(xì)胞凋亡檢測(TUNEL)試劑盒、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒、兔抗鼠Hsp-70、Bcl-2、Bax抗體(武漢博士德有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3個(gè)月健康雄性SD大鼠60只，體重250～280 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SYXK(京)2017-0012。動(dòng)物飼料、飲用水均消毒處理，室內(nèi)溫度、濕度恒定。

2 方法

2.1 分組與腦缺血再灌注損傷模型的制備 60只SD大鼠隨機(jī)均分成3組，每組20只。造模前12 h，藥物預(yù)處理組給予丹皮酚(100 mg·L-1)，模型組和假手術(shù)組給予等量生理鹽水，均采用腹腔注射。模型組和丹皮酚預(yù)處理組采用頸外動(dòng)脈線栓法并加以改良制作腦缺血再灌注損傷模型[4]。手術(shù)前大鼠禁食禁水10～12 h，腹腔注射10%水合氯醛(1 mL·kg-1)麻醉，將麻醉大鼠仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺上，頸部脫毛，切開頸部皮膚，分離出左側(cè)頸總動(dòng)脈、翼顎動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，并將頸總動(dòng)脈、翼顎動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈結(jié)扎，同時(shí)在頸總動(dòng)脈上切一個(gè)小口，采用直徑約0.25 mm的高彈力碳素魚線作為線栓，將線頭蘸蠟制成約0.25 mm的光滑線頭，然后蘸取肝素，從切口處輕柔推進(jìn)插入線栓，使其沿頸內(nèi)動(dòng)脈入顱，進(jìn)線約16～18 mm后如感到阻力即停止推送線栓，阻塞左側(cè)大腦中動(dòng)脈。血流阻斷2 h后拔出線栓恢復(fù)血流，形成再灌注損傷模型。假手術(shù)組大鼠不結(jié)扎大腦中動(dòng)脈血管，未做再灌注損傷處理。

2.2 神經(jīng)功能評分 造模成功后，待大鼠清醒，按照Bederson評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分。具體評分標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(0分)―大鼠無神經(jīng)功能障礙；1級(1分)―提大鼠尾部，可見癱瘓側(cè)肢體屈曲困難不能正常伸向地面；2級(2分)―除1級癥狀外，推癱瘓側(cè)肢體時(shí)感覺阻力較另一側(cè)明顯減輕；3級(3分)―除1級癥狀外，大鼠在爬行時(shí)不自主地向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)；4級(4分)：大鼠伴有意識障礙。評分為0分、4分或死亡動(dòng)物剔除，評分為1～3分，無蛛網(wǎng)膜下腔出血的動(dòng)物才可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 標(biāo)本采集 造模成功后，各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 mL·kg-1)麻醉，將麻醉大鼠固定于手術(shù)臺上，剪開胸腔露出心臟。采用心臟灌注固定方法取腦，制備約5 μm 厚度石蠟切片，用于檢測大鼠腦梗死體積、海馬細(xì)胞凋亡及Hsp-70、Bcl-2、Bax表達(dá)。

2.4 TTC染色法檢測大鼠腦梗死體積 將腦組織切片用TTC進(jìn)行染色，正常腦組織染成紅色，梗死腦組織染成白色。然后將腦組織切片用甲醛的磷酸鹽緩沖液固定。隨后用計(jì)算機(jī)圖像軟件掃描腦組織切片，測量大鼠的腦梗死面積，進(jìn)而換算出大鼠的腦梗死體積。

2.5 TUNEL法檢測海馬細(xì)胞凋亡 切片經(jīng)TUNEL混合液37 ℃孵育2 h；POD轉(zhuǎn)化劑37 ℃轉(zhuǎn)化40 min后磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗；DAB顯色；蘇木精復(fù)染；脫水、二甲苯透明后封固切片。每張切片在400倍顯微鏡下取海馬CA1區(qū)大致相同部位的6個(gè)互不重疊視野，觀察并計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)，凋亡細(xì)胞細(xì)胞核呈棕黃色染色。

2.6 免疫組化染色法檢測海馬細(xì)胞Hsp-70、Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá) 大鼠造模成功后取尾狀核平面切片，按常規(guī)免疫組化技術(shù)及試劑說明書要求分別進(jìn)行Hsp-70、Bcl-2及Bax抗體染色。然后在光鏡下觀察，HSP-70陽性細(xì)胞位于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中，均呈藍(lán)色，尤其以細(xì)胞核周圍最為明顯。Bcl-2及Bax陽性細(xì)胞僅位于細(xì)胞質(zhì)，Bcl-2陽性細(xì)胞呈褐色或者棕黃色，均勻彌漫樣染色；Bax陽性細(xì)胞呈藍(lán)色，核淡染色；每張切片在400倍光鏡下取出血灶邊緣相互不重疊的6個(gè)視野，觀察并計(jì)數(shù)切片的陽性細(xì)胞總數(shù)量。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損和腦梗死體積比較 腦缺血再灌注損傷后，模型組及丹皮酚預(yù)處理組大鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損、梗死灶等表現(xiàn)。與模型組比較，丹皮酚預(yù)處理組大鼠神經(jīng)功能評分和腦梗死體積明顯減少(P<0.05)，結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分和腦梗死體積

3.2 各組大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡水平比較 假手術(shù)組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)域內(nèi)未見TUNEL陽性細(xì)胞。腦缺血再灌注損傷后，模型組及丹皮酚預(yù)處理組大鼠腦缺血再灌注周圍皮質(zhì)區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)TUNEL陽性細(xì)胞。與模型組比較，丹皮酚預(yù)處理組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)，結(jié)果見表2、圖1。

A.模型組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)；B.丹皮酚預(yù)處理組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)

3.3 各組大鼠HSP-70、Bcl-2及Bax陽性細(xì)胞數(shù)比較 腦缺血再灌注損傷后，模型組及丹皮酚預(yù)處理組海馬細(xì)胞周圍Bcl-2、Bax、Hsp-70陽性細(xì)胞數(shù)發(fā)生了變化。與模型組比較，丹皮酚預(yù)處理組Bax陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，Hsp-70及Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.05)，結(jié)果見表2、圖2。

表2 各組大鼠Hsp-70、Bcl-2、Bax陽性細(xì)胞數(shù)(n=10，個(gè)/視野，

圖2 各組大鼠Hsp-70、Bcl-2、Bax陽性細(xì)胞數(shù)(免疫組化染色，×400)

4 討論

缺血性腦血管病尤其是腦缺血后再灌注損傷對身體危害極大，腦缺血后局部血流受阻可導(dǎo)致腦細(xì)胞迅速死亡，快速恢復(fù)缺血部位腦組織的血供是防止腦細(xì)胞損傷的首要條件，但是再灌注之后恢復(fù)血流同時(shí)也可能會進(jìn)一步加重缺血性損傷，即缺血再灌注損傷[5]。細(xì)胞凋亡在缺血再灌注損傷中起著重要作用。目前研究的熱點(diǎn)是通過減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到治療的目的[6]。研究發(fā)現(xiàn)，Hsp-70、Bcl-2及Bax與細(xì)胞凋亡有著密切的關(guān)系。Bcl-2與Bax是一組調(diào)控細(xì)胞凋亡的競爭性蛋白，Bcl-2具有抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞存活的作用；Bax具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡及死亡的作用，Bax減少或Bcl-2增多均可能與神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)[7]。Hsp-70是一類應(yīng)激性保護(hù)蛋白。在腦缺血情況下，Hsp-70可作為應(yīng)激反應(yīng)的一個(gè)可靠標(biāo)志物，其神經(jīng)保護(hù)作用可能與抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊等作用有關(guān)；另外，Hsp-70還可以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、提高神經(jīng)組織對腦缺血的耐受?，F(xiàn)已公認(rèn)Hsp-70為腦缺血性損傷中具有保護(hù)作用的蛋白，在促進(jìn)腦細(xì)胞修復(fù)、腦缺血損傷恢復(fù)等過程中起著重要作用[8]。

丹皮酚又稱牡丹酚，是毛茛科植物牡丹根皮的主要有效單體成分。具有抗癌、保肝、神經(jīng)保護(hù)、抗菌消炎、保護(hù)心血管等藥理作用。作為具有多種藥理作用的傳統(tǒng)中藥，逐漸引起醫(yī)藥界的重視。已有文獻(xiàn)報(bào)道，丹皮酚通過抑制興奮性氨基酸的毒性作用，抗自由基缺損，阻止鈣離子內(nèi)流等機(jī)制對腦缺血具有一定的保護(hù)作用[9-11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腦缺血再灌注損傷后，大鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損、梗死灶等表現(xiàn)，與模型組比較，丹皮酚預(yù)處理組，大鼠腦梗死灶縮小、神經(jīng)功能缺損有所改善，說明丹皮酚起到了腦神經(jīng)的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了腦缺血再灌注損傷后，腦缺血再灌注海馬細(xì)胞周圍TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)和Bcl-2、Bax、Hsp-70蛋白表達(dá)發(fā)生了變化，說明細(xì)胞凋亡機(jī)制參與了腦缺血再灌注損傷，與模型組比較，丹皮酚預(yù)處理組，TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)和Bax蛋白的表達(dá)減少，而Bcl-2和Hsp-70蛋白的表達(dá)增加，說明丹皮酚能有效上調(diào)Hsp-70、Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕腦組織損傷。這為缺血性腦卒中的二級預(yù)防治療，頸動(dòng)脈狹窄解除、顱腦損傷、顱內(nèi)占位切除等術(shù)前治療后的預(yù)后改善提供了新的途徑，也為臨床上缺血性腦卒中的治療提供了一定的參考。

綜上所述，在腦缺血再灌注損傷前給予丹皮酚預(yù)處理能有效改善腦組織損傷，其機(jī)制可能與上調(diào)Hsp-70、Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，減輕腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。除此之外，丹皮酚是否通過其他途徑對損傷的腦神經(jīng)起到一定的保護(hù)作用，還需進(jìn)一步深入研究。