張娟 王江紅 張帥 田利杰 王寶利 李長義

特發(fā)性髁突吸收（idiopathic condylar resorption，ICR）是一種特發(fā)于顳下頜關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨的退行性病變，發(fā)病人群主要為15~35歲的青少年，尤其是青春期生長驟增期間［1］，男女比例約1∶9［2］。ICR主要臨床癥狀包括下頜支發(fā)育短小、前牙開及面下1/3發(fā)育不足等，阻礙青少年的頜面部發(fā)育，影響青少年的身心健康。髁突作為下頜骨生長發(fā)育中心之一，當(dāng)ICR發(fā)生時，髁突發(fā)育受抑制，關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨可見破壞。錐形束CT（Cone beam Computer Tomography，CBCT）檢查可見，髁突發(fā)生退行性變，骨皮質(zhì)吸收不完整［3］，髁突垂直發(fā)育不良，表現(xiàn)為髁突高度降低，髁寬變小［4］，隨著病情的進(jìn)展，髁突形態(tài)改變會愈發(fā)明顯［5］。從結(jié)構(gòu)上看，髁突表面覆蓋纖維軟骨，軟骨細(xì)胞不僅能表達(dá)Ⅱ型膠原蛋白保持軟骨細(xì)胞的彈性功能，使髁突有足夠能力緩沖外界給予的壓應(yīng)力；還有增殖、分化、骨化成骨的作用，促進(jìn)下頜骨的生長發(fā)育。

人類流行病學(xué)調(diào)查及動物實驗等證明，ICR的發(fā)生與雌激素水平異常密切相關(guān)［6，7］，雌激素濃度過高或過低均不利于軟骨細(xì)胞的增殖分化，且雌激素對髁突軟骨細(xì)胞的作用呈時間依賴性［8，9］，但目前未有研究得出有利于髁突軟骨細(xì)胞增殖的確切雌激素濃度?；蚣暗鞍姿窖芯勘砻?，雌激素受體（estrogen receptor，ER）α、β在髁突軟骨細(xì)胞中表達(dá)，其中，ERα在髁突軟骨的過渡層和肥大層表達(dá)較多，且分布于軟骨細(xì)胞內(nèi)，ERβ大多表達(dá)于髁突軟骨的肥大層，且集中分布在軟骨細(xì)胞的細(xì)胞核中［10］。雌激素在生理水平會上調(diào)髁突軟骨細(xì)胞ERα表達(dá)，下調(diào)ERβ表達(dá)，在10-9mmol/L雌激素濃度下，E2最能上調(diào)ERα基因表達(dá)［11］。另有研究證明，當(dāng)雌激素水平降低時，髁突軟骨細(xì)胞中ERα、β的表達(dá)會同時下降［12］，但上述研究只是單方面證明雌激素濃度變化對某一基因表達(dá)的影響，且實驗分組雌激素濃度變化跨度大。故本實驗設(shè)計雌激素濃度變化跨度小，旨在探討能促進(jìn)髁突軟骨細(xì)胞增殖的最佳雌激素濃度，以及雌激素濃度變化對ERs及Col II表達(dá)的影響。

1.材料與方法

1.1 材料4周齡雌性SD大鼠（斯貝福）、雌激素（MCE）、CCK-8試劑盒（MCE）、ERα抗體（Bio-oss）、ERβ抗體（ABclonal）、Col II抗體（Proteintech）。

1.2 提取原代髁突軟骨細(xì)胞及細(xì)胞鑒定 獲取4周齡雌性SD大鼠髁突軟骨塊，胰酶-膠原酶分步消化法提取髁突軟骨細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞接種及原代培養(yǎng)，光學(xué)顯微鏡下觀察提取細(xì)胞的形態(tài)，配置甲苯胺藍(lán)工作液進(jìn)行細(xì)胞鑒定：10%中性甲醛固定軟骨細(xì)胞后，ddH2O沖洗，隨后用甲苯胺藍(lán)染色2h，置于顯微鏡下觀察。

1.3 細(xì)胞生長曲線測定 據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)時對細(xì)胞生長速度的觀察，細(xì)胞增殖速度從第一代開始逐漸加快，傳至第四代后逐漸減慢。當(dāng)原代軟骨細(xì)胞傳至第三代時，待髁突軟骨細(xì)胞達(dá)到70%~80%滿底時，0.25%胰酶消化，后用含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化并將其配制成密度為1×105個/mL的細(xì)胞懸液，接種于6孔板內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后分別計數(shù)3孔的細(xì)胞數(shù)，每孔計數(shù)3次，取3孔細(xì)胞數(shù)的均值作為其計數(shù)時的細(xì)胞數(shù)。以后每隔24h分別計數(shù)3孔的細(xì)胞數(shù)，共計數(shù)7d，并繪制細(xì)胞生長曲線。

1.4 雌激素濃度改變對細(xì)胞增殖的影響 二甲基亞砜（DMSO）溶解雌激素，配制成不同濃度的雌激素溶液。當(dāng)原代細(xì)胞傳至第三代時，將細(xì)胞重懸、接種至96孔板中，37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，細(xì)胞貼壁伸展后，進(jìn)行不同干預(yù)。處理因素分為空白組（只含培養(yǎng)基）、對照組（軟骨細(xì)胞無干預(yù)）、DMSO組、不同雌激素濃度干預(yù)組（10-12mol/L、10-11mol/L、10-10mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L），其中DMSO組及不同雌激素濃度干預(yù)組所含DMSO濃度均為0.1%。干預(yù)24h后，快速加入CCK-8液10μL，37℃恒溫箱孵育2h后，酶標(biāo)儀測定其在450nm處的吸光度，根據(jù)公式計算軟骨細(xì)胞增殖率。

細(xì)胞增殖率=（實驗組-空白組）/（對照組-空白組）×100%

1.5 不同濃度雌激素干預(yù)及相關(guān)基因mRNA和蛋白檢測 當(dāng)原代軟骨細(xì)胞傳至第三代時，將細(xì)胞重懸、分別接種至24孔板和6孔板中，37℃恒溫箱培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁伸展后，進(jìn)行不同干預(yù)，處理因素分為對照組（軟骨細(xì)胞無干預(yù)）、DMSO組、不同雌激素濃度干預(yù)組（10-12mol/L、10-11mol/L、10-10mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L）。其中DMSO組及不同雌激素濃度干預(yù)組所含DMSO濃度均為0.1%。分別干預(yù)24h后，提取軟骨細(xì)胞mRNA和蛋白，應(yīng)用RT-PCR和WB技術(shù)檢測ERα、ERβ、Col II基因和蛋白表達(dá)量的差異。應(yīng)用image J軟件分析ERα、ERβ、Col II蛋白條帶的灰度值，先計算目的蛋白灰度值與對應(yīng)分組β-actin蛋白灰度值的比值后，將對照組相對值設(shè)為1，計算相對表達(dá)量后形成柱狀圖。RT-PCR引物序列見表1。

表1 RT‐PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 23.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有實驗均重復(fù)三次及以上，所得數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（xˉ±s）。組間比較采用t檢驗，當(dāng)P＜0.05時認(rèn)為組間存在顯著性差異。

2.結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察及細(xì)胞鑒定 提取髁突軟骨細(xì)胞后，顯微鏡觀察，剛接種的軟骨細(xì)胞呈圓形，大約2h后貼壁，24h后，軟骨細(xì)胞會伸出許多觸角，形態(tài)呈多角形（圖1）。此后，細(xì)胞密度逐漸增加，至7d左右長滿培養(yǎng)皿底部。甲苯胺藍(lán)染色可見胞質(zhì)淡藍(lán)染，胞核深藍(lán)染。甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果證明提取的細(xì)胞是大鼠髁突軟骨細(xì)胞。

圖1 顯微鏡下髁突軟骨細(xì)胞形態(tài)觀察

2.2 測定細(xì)胞生長曲線 利用提取的原代軟骨細(xì)胞測定細(xì)胞生長曲線，如圖所示（圖2），軟骨細(xì)胞增殖在前兩天處于平臺期（P＞0.05）；從第2d進(jìn)入對數(shù)生長期，至第5d生長逐漸緩慢。

圖2 髁突軟骨細(xì)胞生長曲線

2.3 雌激素濃度對軟骨細(xì)胞增殖的影響CCK-8測定軟骨細(xì)胞增殖率結(jié)果顯示（圖3），與DMSO組相比，10-10~10-7mol/L的雌激素能促進(jìn)髁突軟骨細(xì)胞增殖（P＜0.05），當(dāng)雌激素濃度在10-9mol/L時，對軟骨細(xì)胞促增殖作用優(yōu)于其他組。以DMSO為溶劑不會影響髁突軟骨細(xì)胞的增殖。

圖3 CCK-8試劑盒測定髁突軟骨細(xì)胞增殖率

2.4 雌激素濃度對軟骨細(xì)胞基因表達(dá)影響

RT-PCR及WB結(jié)果表明，雌激素濃度變化對大鼠髁突軟骨細(xì)胞不同基因的表達(dá)量會產(chǎn)生不同影響，DMSO組與對照組相比，DMSO的加入能促進(jìn)ERα、β和Col II表達(dá)，所以實驗組應(yīng)與DMSO組進(jìn)行比較，并做統(tǒng)計學(xué)分析。故與DMSO組相比較，雌激素對ERα及Col II的表達(dá)表現(xiàn)為促進(jìn)作用，10-11~10-9mol/L的雌激素促進(jìn)ERα的表達(dá)，10-9mol/L的雌激素對ERα的促表達(dá)作用優(yōu)于其他組；當(dāng)雌激素濃度為10-8~10-6mol/L時，能促進(jìn)Col II的表達(dá)，10-7mol/L的雌激素對Col II表達(dá)的促進(jìn)作用優(yōu)于其他組；而10-10mol/L的雌激素會對ERβ的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用（圖4、5），以上結(jié)果均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。如圖6所示，ERα、ERβ、Col II蛋白表達(dá)的灰度值分析也得出如上結(jié)果。因此，10-8~10-7mol/L的雌激素既有利于髁突軟骨細(xì)胞增殖，又能促進(jìn)Col II表達(dá)。

圖4 RT-PCR檢測大鼠髁突軟骨細(xì)胞ERα、ERβ、Col2 a1 mRNA表達(dá)

圖6 ERα、ERβ、Col II蛋白表達(dá)的灰度值分析

10-10mol/L vs DMSOP=0.0002，10-9mol/L vs DMSOP＜0.0001，10-8mol/L vs DMSOP＜0.0001，10-7mol/L vs DMSOP=0.0036。

ERα：DMSO與conP=0.0019，10-11mol/L與DMSOP=0.0289，10-10mol/L與DMSOP=0.0270，10-9mol/L與DMSOP=0.0169；

ERβ：DMSO與conP=0.0056，10-10mol/L與DMSOP=0.0092，10-6mol/L與DMSOP=0.0138；

Col2a1：DMSO與conP=0.0112，10-8mol/L與DMSOP=0.0468，10-7mol/L與DMSOP=0.0014，10-6mol/L與DMSOP=0.0350。

圖5 蛋白免疫印跡檢測大鼠髁突軟骨細(xì)胞ERα、ERβ、Col II蛋白的表達(dá)

3.結(jié)論

本實驗利用胰酶-膠原酶聯(lián)合消化法成功提取4周齡雌性SD大鼠髁突軟骨細(xì)胞。并應(yīng)用分組跨度較小的雌激素濃度分組來進(jìn)行了軟骨細(xì)胞增殖及相關(guān)基因表達(dá)測定的體外實驗。實驗證明，與對照組相比，10-9mol/L的雌激素對髁突軟骨細(xì)胞增殖及ERα表達(dá)的促進(jìn)作用優(yōu)于其他組；10-7mol/L的雌激素對Col II的促表達(dá)作用優(yōu)于其他組；而雌激素濃度的變化會對ERβ的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用，10-10mol/L最為顯著。雌激素促進(jìn)髁突軟骨細(xì)胞增殖和ERα、Col II基因表達(dá)，而在這些濃度下抑制ERβ基因和蛋白的表達(dá)。

4.討論

本實驗研究證明，與DMSO組相比，10-9mol/L的雌激素對髁突軟骨細(xì)胞增殖和ERα基因的促表達(dá)作用優(yōu)于其他組；10-7mol/L的雌激素對Col II表達(dá)的促進(jìn)作用優(yōu)于其他組；而雌激素濃度的變化會對ERβ的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用，10-10mol/L最為顯著。以往研究雌激素濃度分組跨度大，基本為10-12mol/L~10-6mol/L［11］或10-12mol/L~10-4mol/L［13］，本實驗基于以往研究的雌激素濃度分組［11］，制定了一組雌激素濃度跨度較小的分組，進(jìn)行更精確的實驗研究。國內(nèi)外均有學(xué)者證明，不論是在大關(guān)節(jié)包括膝關(guān)節(jié)或椎間盤，還是針對顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨細(xì)胞，正常生理濃度的雌激素對關(guān)節(jié)軟骨及軟骨細(xì)胞有保護(hù)作用，調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的生物學(xué)功能和基因表達(dá)［14-16］，雌激素濃度過高或過低均不利于軟骨細(xì)胞的增殖［17-19］。但未有研究給出有利于軟骨細(xì)胞增殖的確切雌激素濃度?；诒緦嶒灥拇萍に貪舛确纸M證明，10-9mol/L的雌激素最能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，隨著雌激素濃度的增高或降低，雌激素對軟骨細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用逐漸減弱，這與以往研究結(jié)果相符。

雌激素主要通過ERα通道調(diào)節(jié)軟骨形成、骨生長和生長板成熟［20，21］，關(guān)于基因表達(dá)的既往研究表明10-9mol/L的雌激素濃度最能促進(jìn)SD大鼠髁突軟骨細(xì)胞ERα的表達(dá)［11］，本實驗與其結(jié)果一致。但在以往的研究中，雌激素濃度分組跨度大，不精確，且只測定了ERα mRNA的表達(dá)。從本實驗RT-PCR結(jié)果可看出，10-11~10-9mol/L的雌激素能促進(jìn)ERα基因的表達(dá)，10-9mol/L濃度的雌激素對ERα基因的促表達(dá)作用優(yōu)于本實驗其他分組，WB結(jié)果也表明，當(dāng)雌激素濃度為10-11~10-9mol/L時，ERα蛋白表達(dá)量明顯增加，10-9mol/L增加較其他組明顯，且隨著雌激素濃度的升高或降低，ERα mRNA及蛋白表達(dá)量逐漸減低，說明雌激素對ERα基因表達(dá)具有雙向調(diào)節(jié)作用。

Col II是由軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的，主要存在于關(guān)節(jié)、骨骼和肌腱等組織中的有減震、緩沖作用的重要物質(zhì)。正常水平的雌激素能促進(jìn)Col II表達(dá)，10-7M劑量下的雌激素能最大限度地促進(jìn)Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)［21］，本實驗結(jié)果與其一致。但有實驗證明，雌激素以時間和劑量依賴性方式通過ERβ通路抑制小鼠椎間盤生長板軟骨細(xì)胞的增殖、分化，降低Ⅱ型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖的表達(dá)，發(fā)揮抑制作用的最佳雌激素濃度為10-7/-6M［22］，即雌激素可通過ERβ通路調(diào)節(jié)Col II的表達(dá)，與本實驗結(jié)果相反。本實驗研究證明10-10mol/L的雌激素對ERβ具有抑制作用，而雌激素促進(jìn)Col II表達(dá)時，對ERβ的促進(jìn)作用并不明顯，可能是由于上述實驗研究的是小鼠椎間盤軟骨細(xì)胞，而本實驗為SD大鼠髁突軟骨細(xì)胞，實驗動物品系及研究部位不同，可見雌激素對不同品系的生命體軟骨細(xì)胞的作用可能不同，故而對人髁突軟骨細(xì)胞的研究更加迫在眉睫。

通過本實驗研究證明，10-9mol/L的雌激素能促進(jìn)大鼠髁突軟骨細(xì)胞增殖和基因ERα表達(dá)，10-7mol/L濃度的雌激素能促進(jìn)Col II表達(dá)，而雌激素對ERβ促進(jìn)作用并不明顯，并在10-10mol/L時抑制其表達(dá)。對于髁突軟骨組織來說，ERs是雌激素作用于軟骨細(xì)胞的經(jīng)典核受體通路，Col II是軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的能夠使軟骨組織對抗外界壓應(yīng)力的主要物質(zhì)，探索雌激素濃度變化對ERα、β及Col II基因表達(dá)影響的基礎(chǔ)研究對于ICR的預(yù)防和治療具有一定的臨床意義。