張小雪，孫天歌，張迎春，陳麗華，張新宇，李艷軍，孫杰

大麗輪枝菌木糖苷酶基因的鑒定及基于HIGS技術(shù)的功能分析

張小雪，孫天歌，張迎春，陳麗華，張新宇，李艷軍，孫杰

石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆石河子 832003

【】從大麗輪枝菌（）中鑒定木糖苷酶基因，研究其與大麗輪枝菌致病力的關(guān)系，為解析大麗輪枝菌致病分子機制提供理論依據(jù)，同時為制定更好的棉花黃萎病防治策略提供科學(xué)依據(jù)。利用生物信息學(xué)方法從大麗輪枝菌基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定全部木糖苷酶基因，并對基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域、基因的染色體定位及進化關(guān)系等進行分析。利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測木糖苷酶基因在不同抗/感棉花品種根系分泌物培養(yǎng)0、6、12、24和48 h大麗輪枝菌中的表達量。利用寄主誘導(dǎo)的基因沉默（host-induced gene silencing，HIGS）技術(shù)對木糖苷酶基因在大麗輪枝菌侵染過程中的功能進行初步分析。將的目標片段轉(zhuǎn)化棉花，采用傷根法接種大麗輪枝菌Vd991，觀察轉(zhuǎn)化植株的表型，調(diào)查病情指數(shù)，同時利用qRT-PCR技術(shù)對植株中真菌生物量和的表達量進行檢測。利用生物信息學(xué)方法從大麗輪枝菌中查找出13個木糖苷酶基因（—），其編碼序列長度介于1 461—2 544 bp，蛋白質(zhì)分子量介于38.78—90.97 kD，理論等電點介于4.67—5.89。結(jié)構(gòu)域和進化樹分析發(fā)現(xiàn)13個木糖苷酶基因中包括9個糖苷水解酶43家族成員、1個3家族成員和3個31家族成員。染色體定位分析發(fā)現(xiàn)13個基因分布在6條染色體上，未形成基因簇。qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)選取的6個基因均受到根系分泌物的誘導(dǎo)，在一種或多種根系分泌物中培養(yǎng)6 h或12 h后，表達量均明顯升高，然后降低。其中受海島棉根系分泌物誘導(dǎo)后表達量明顯升高，表明該基因的表達明顯受海島棉根系分泌物的誘導(dǎo)。HIGS研究結(jié)果表明，接菌14 d和21 d后轉(zhuǎn)化基因干擾片段的棉花發(fā)病明顯較重，其病情指數(shù)（33.3和83.9）明顯高于空載體對照（21.7和66.1）。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化基因干擾片段的棉花植株莖中的表達量明顯低于空載體對照，真菌生物量顯著多于對照。利用HIGS技術(shù)將基因沉默后，棉株的抗病性明顯降低，表明在大麗輪枝菌致病及宿主-病原體互作過程中可能發(fā)揮著重要的作用。

棉花；大麗輪枝菌；黃萎病；；木糖苷酶；寄主誘導(dǎo)的基因沉默

0 引言

【研究意義】我國是世界上主要的棉花生產(chǎn)和消費國，新疆是最大的植棉省區(qū)，已連續(xù)25年保持單產(chǎn)、總產(chǎn)和調(diào)出量全國第一。2019年新疆棉花播種面積254.05萬公頃，皮棉產(chǎn)量500.2萬噸，分別占全國的76.1%和84.9%，棉花產(chǎn)業(yè)已成為新疆的重要經(jīng)濟支柱和農(nóng)民收入的主要來源。棉花黃萎病是一種土傳性維管束真菌病害[1]，嚴重影響棉花的產(chǎn)量和纖維品質(zhì)[2]。我國棉區(qū)的黃萎病主要是由大麗輪枝菌（）引起[3]。大麗輪枝菌入侵寄主后，其菌絲體大量生長阻礙植物木質(zhì)部對營養(yǎng)物質(zhì)的運輸[4]，同時產(chǎn)生水解酶和毒素等物質(zhì)作用于寄主，最終導(dǎo)致植株死亡[1,5]。由于大麗輪枝菌具有穩(wěn)定存在的微菌核結(jié)構(gòu)以及多變的生理型，棉花黃萎病至今難以防治。挖掘大麗輪枝菌致病相關(guān)基因并進行功能驗證，對揭示大麗輪枝菌的致病分子機制以及制定更好的棉花黃萎病防治策略具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】近年來，隨著大麗輪枝菌全基因組測序的完成和生物信息學(xué)工具的發(fā)展，其致病相關(guān)基因的挖掘及功能研究已取得較大進展[6-10]，但由于大麗輪枝菌致病機制非常復(fù)雜，其研究仍處于探索階段。大麗輪枝菌入侵過程中會產(chǎn)生胞外分泌蛋白，其中含有大量的植物細胞壁降解酶，能夠降解寄主植物的細胞壁多糖以達到入侵和定殖的目的[1,5,11]。植物細胞壁的橫向結(jié)構(gòu)主要由半纖維素和木質(zhì)素結(jié)合而成。木聚糖是半纖維素的主要成分，最高可占細胞干重的35%，是植物中第二豐富的生物聚合物，僅次于纖維素。木聚糖的降解在大麗輪枝菌的致病過程中發(fā)揮重要作用[12]。木聚糖酶和木糖苷酶是降解木聚糖的關(guān)鍵酶，前者將木聚糖降解成小片段，后者則利用外切的性質(zhì)將小片段水解釋放木糖[13-14]。已有多種病原菌分泌的木聚糖酶被發(fā)現(xiàn)與其致病力密切相關(guān)[15-16]，然而木糖苷酶與致病力的關(guān)系尚不清楚。依據(jù)木糖苷酶水解的糖苷鍵不同，可分為-木糖苷酶和-木糖苷酶兩種類型。依據(jù)氨基酸序列相似性，在Carbohydrate Active Enzymes數(shù)據(jù)庫（CAZy，http://www.cazy.org/）中-木糖苷酶被劃分為GH31家族，-木糖苷酶被歸類于糖苷水解酶GH3、GH30、GH39、GH43、GH52、GH54和GH120家族。-木糖苷酶的相關(guān)報道較多，目前狹義的木糖苷酶一般指的是-木糖苷酶。-木糖苷酶在自然界中廣泛存在，在高等植物和微生物中均已得到分離，在能源工業(yè)、造紙工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)中已得到廣泛應(yīng)用[17-18]?！颈狙芯壳腥朦c】真菌中已有多個木糖苷酶基因被克隆[19-20]，大麗輪枝菌中木糖苷酶基因的鑒定及功能研究尚未見報道。實驗室前期通過對不同抗性棉花品種的根系分泌物培養(yǎng)大麗輪枝菌的轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)一個木糖苷酶基因（VDAG_01866）能夠響應(yīng)感病棉花品種的根系分泌物，暗示其在大麗輪枝菌早期寄主識別和侵染過程中發(fā)揮著重要作用[21]。【擬解決的關(guān)鍵問題】對大麗輪枝菌木糖苷酶基因進行全基因組鑒定和生物信息學(xué)分析，并利用qRT-PCR技術(shù)檢測木糖苷酶基因在3種根系分泌物培養(yǎng)不同時間大麗輪枝菌中的表達量。利用寄主誘導(dǎo)的基因沉默（host-induced gene silencing，HIGS）技術(shù)對在棉花致病過程中的功能進行分析，探討木糖苷酶基因與大麗輪枝菌致病力的關(guān)系。

1 材料與方法

試驗于2019—2020年在石河子大學(xué)完成。

1.1 供試材料及處理

供試材料為陸地棉（）新陸早8號（感病品種）、中植棉2號（耐病品種）和海島棉（）海7124（抗病品種），均由石河子大學(xué)棉花研究所提供。大麗輪枝菌強致病菌株Vd991由石河子大學(xué)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點實驗室保存。

1.1.1 棉苗的種植 將棉種在溫水中浸泡8—12 h后，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽，挑選發(fā)芽整齊一致的種子均勻種植在霍格蘭營養(yǎng)液中，每盆種植18棵棉苗，每3 d添加一次霍格蘭營養(yǎng)液使總體積保持5 L，培養(yǎng)30 d后收集根系分泌物。先用濾紙對每盆中液體進行過濾，再用細菌過濾器（直徑0.22 μm）進行過濾，然后在冷凍干燥機中將過濾后的溶液濃縮至1 L，放置在4℃冰箱備用。另外，挑選發(fā)芽整齊一致的種子均勻種在等體積混合的營養(yǎng)土與蛭石中，培養(yǎng)溫度26℃，相對濕度80%，光周期16 h光照/8 h黑暗，待植株長出2片真葉后用于農(nóng)桿菌的注射和大麗輪枝菌的脅迫處理。

1.1.2 大麗輪枝菌樣本的制備 挑取PDA培養(yǎng)基上生長10 d左右的菌塊接種于200 mL查氏液體培養(yǎng)基中，26℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)5—7 d，分裝入50 mL離心管中，12 000 r/min收集Vd991菌體。每份稱取0.5 g菌體，分別加入10 mL根系分泌物，培養(yǎng)0、6、12、24和48 h后收集菌體，設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，共收集45份菌體。

1.2 方法

1.2.1木糖苷酶基因的鑒定及亞細胞定位預(yù)測 從大麗輪枝菌數(shù)據(jù)（https://fungi.ensembl.org/ Verticillium_ dahliae/Search/ Results?Species=Verticillium%20dahliae; idx=;q=arabinosidase;site=ensemblthis）網(wǎng)站下載Verticillium_dahliae. ASM15067v2. GFF3、CDS、genomic和protein序列文件，利用TBtools軟件對GFF3文件中所有木糖苷酶基因進行搜索，初步獲得大麗輪枝菌木糖苷酶基因，同時在CDS、蛋白質(zhì)、全基因組序列文件中獲取基因?qū)?yīng)的cDNA序列、蛋白質(zhì)序列以及基因組序列。利用SMART在線軟件（http://smart.Emblh eidelberg.de/）進一步分析基因是否具有糖苷水解酶家族的主結(jié)構(gòu)域，去除不完整的短片段和重復(fù)的序列，最終確定大麗輪枝菌中全部木糖苷酶基因。利用在線軟件ExPASy-ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）分析氨基酸序列的蛋白質(zhì)殘基數(shù)（aa）、分子量（kD）和等電點（pI）。利用在線軟件ProtComp9.0（http://www.softberry.com/ berry.phtml?topic=protcomppl&group=programs&subgroup =proloc）對蛋白質(zhì)的亞細胞定位進行預(yù)測。

1.2.2 木糖苷酶基因的生物信息學(xué)分析 利用SMART在線軟件預(yù)測木糖苷酶基因蛋白信號肽和結(jié)構(gòu)域，利用DOG2.0軟件繪制蛋白的結(jié)構(gòu)域圖。以13個木糖苷酶基因蛋白序列的主結(jié)構(gòu)域為探針序列，利用NCBI Blast P（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行序列比對，從搜索結(jié)果中選擇E值小、Score值大的來自其他物種的木糖苷酶基因序列。利用MEGA6.0提供的ClustalW程序?qū)Υ篼愝喼捌渌锓N中的木糖苷酶基因蛋白序列進行多重序列比對，然后通過臨位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。從大麗輪枝菌數(shù)據(jù)庫下載木糖苷酶基因的CDS、基因組序列，利用在線軟件Gene Structure Display Server（GSDS）（http://gsds.cbi.pku.edu.cn）分析木糖苷酶基因外顯子-內(nèi)含子的數(shù)目及分布。從大麗輪枝菌全基因組數(shù)據(jù)庫中獲得木糖苷酶基因染色體分布以及長度信息，利用Map Inspect繪制木糖苷酶基因染色體定位圖。

1.2.3 大麗輪枝菌總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 利用Fungal RNA Kit（OMEGA）提取大麗輪枝菌樣本總RNA，用DNase Ⅰ消解DNA后，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，利用NanoDrop 2000 DNA濃度測定儀測定RNA的濃度和OD260nm/ OD280 nm值。用MMLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，保存于-20℃冰箱備用。

1.2.4 木糖苷酶基因的表達分析 依據(jù)進化樹分類結(jié)果及實驗室前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[21]，從GH3、GH31和GH43 3個糖苷水解酶家族中挑選6個基因（、、、、和），其中來自GH3家族，和來自GH43家族，、和來自GH31家族。設(shè)計這6個木糖苷酶基因的特異性引物（表1），以培養(yǎng)0、6、12、24和48 h大麗輪枝菌的cDNA為模板，利用qRT-PCR對基因的表達模式進行分析，大麗輪枝菌微管蛋白基因作為內(nèi)參基因。qRT-PCR反應(yīng)在美國羅氏 LightCycler? 480系統(tǒng)上進行，反應(yīng)參數(shù)：94℃ 1 min；94℃ 15 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s；40次循環(huán)，所有反應(yīng)設(shè)置3次重復(fù)，按照 2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量。

表1 引物序列

劃線部分為酶切位點The underlined part is the restriction site.R I: GAATTC;I: GGTACC

1.2.5 基于HIGS技術(shù)的基因沉默 木糖苷酶基因干擾片段的克隆：根據(jù)NCBI網(wǎng)站Primer3-Blast在線設(shè)計的特異引物-F/R，在上下游引物中分別引入R I和I酶切位點（表1），以大麗輪枝菌cDNA為模板擴增的干擾片段。PCR反應(yīng)體系（20 μL）：ddH2O 13.2 μL，10×Ex Taq Buffer 2 μL，dNTP Mix（2.5 mmol·L-1）1.6 μL，cDNA模板1 μL；上游引物-F1（10 μmol·L-1）1 μL，下游引物-R1（10 μmol·L-1）1 μL，Ex Taq（5 U·μL-1）0.2 μL。擴增條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，29次循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測回收后，連接至pMD19-T simple載體轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆送至深圳華大基因科技有限公司測序，獲得T-重組質(zhì)粒。

HIGS載體的構(gòu)建：提取pTRV2空載體質(zhì)粒和T-重組質(zhì)粒，分別用R I和I進行雙酶切，回收pTRV2載體線性化片段和干擾片段，采用T4DNA連接酶連接回收的兩個片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取單菌落搖培后提取質(zhì)粒，利用PCR和雙酶切對重組質(zhì)粒pTRV2-進行鑒定。

棉花的注射及侵染：用電擊轉(zhuǎn)化法將pTRV1、pTRV2-、空載體pTRV2-和對照載體pTRV2-（該基因突變使葉片失綠）分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。待棉苗兩片子葉平展時，挑取含pTRV1、pTRV2-、pTRV2-和pTRV2-的農(nóng)桿菌單菌落加入30 mL LB液體培養(yǎng)基（卡那霉素50 mg·L-1，利福平25 mg·L-1）中，28℃、200 r/min過夜培養(yǎng)。將搖培的菌液放入4℃離心機5 000 r/min離心10 min收集菌體，加入孢子懸浮液（10 mmol·L-1MgCl2、10 mmol·L-1MES（2-（N-嗎啡啉）乙磺酸）和200 pmol·L-1AS（乙酰丁香酮），重懸后將菌液的濃度調(diào)至OD600=0.8。將準備好的含pTRV2-、pTRV2-和pTRV2-的重懸液分別與含pTRV1的重懸液按照1﹕1的比例混合，室溫靜置3 h后注射棉花。用1 mL無針頭注射器采用壓迫法注射生長10 d的棉苗，將菌液注入展平的子葉中，使菌液充滿整個子葉。含pTRV2-和pTRV2-的重懸液分別注射80棵棉苗，將注射后的棉花放置于22—25℃條件下暗培養(yǎng)12 h，然后恢復(fù)至正常光照培養(yǎng)。

1.2.6 抗病性鑒定 大麗輪枝菌孢子懸浮液的制備：挑取PDA培養(yǎng)基上生長10 d左右的菌塊接種于200 mL查氏液體培養(yǎng)基中，26℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)5—7 d，用滅菌的紗布過濾菌液后獲得孢子懸浮液，在顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)，將孢子懸浮液調(diào)至1.0×107cfu/mL。

病情指數(shù)調(diào)查：注射農(nóng)桿菌菌液后7—10 d，待pTRV2-處理的棉苗真葉完全呈現(xiàn)黃白色時，制備濃度為1×107cfu/mL的大麗輪枝菌孢子懸浮液，采用傷根法侵染棉花感病品種新陸早8號，每株接種20 mL孢子懸浮液。選取20株pTRV2-處理過的棉苗作為水處理對照（Mock）。侵染15—30 d后，對新陸早8號的感病情況進行統(tǒng)計[22]。

真菌生物量檢測：接Vd991后14 d，分別采集pTRV2-和pTRV2-處理棉株的莖，提取總DNA（CTAB法），利用棉花內(nèi)參基因（DQ116441.1）和黃萎病特異引物ITS1-F和ST-Ve1- R[23]進行qRT-PCR，測定其中大麗輪枝菌的生物量。

目標基因表達量檢測：采用EASYspinPlus植物RNA提取試劑盒（Aidlab，北京，中國）提取接菌后14 d棉株莖的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以為內(nèi)參基因，-F和-R為引物，利用qRT-PCR對的表達量進行分析。

大麗輪枝菌恢復(fù)培養(yǎng)：接菌后14 d，隨機選取pTRV2-和pTRV2處理棉苗各10株，用于大麗輪枝菌的恢復(fù)試驗。從暴露于蛭石表面的莖基部切斷植株，向上每隔2 cm取一個莖段，每個植株取3段。將莖段放入75%酒精浸泡30 s，然后在0.1%的升汞溶液中浸泡消毒5 min，無菌水沖洗3—5次，將處理的莖段均勻擺放在PDA平板上，25℃培養(yǎng)7—10 d。待大麗輪枝菌菌落長出后，觀察菌落的生長情況。

2 結(jié)果

2.1 大麗輪枝菌木糖苷酶基因的鑒定

通過大麗輪枝菌基因組數(shù)據(jù)庫的搜索結(jié)合在線工具SMART結(jié)構(gòu)域分析，共鑒定出13個木糖苷酶基因，定名為—（表2）。這些木糖苷酶基因的編碼序列（coding sequence，CDS）長度為1 461— 2 544 bp，編碼的氨基酸為335—834個，蛋白質(zhì)分子量介于38.78—90.97 kD，理論等電點介于4.67—5.89。亞細胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)這些基因大多是細胞膜外的蛋白質(zhì)，部分定位于細胞質(zhì)、膜結(jié)合的溶酶體、細胞核或膜結(jié)合高爾基體上。13個基因中包含4個木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶基因（），1個-葡糖苷酶/-木糖苷酶（），5個-木糖苷酶基因（）和3個-木糖苷酶基因（）。

2.2 大麗輪枝菌木糖苷酶基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域分析

利用SMART在線工具（http://smart.embl-heidelberg. de/smart/batch.pl）對13個木糖苷酶基因編碼蛋白進行了信號肽和結(jié)構(gòu)域預(yù)測，分析發(fā)現(xiàn)VdxyL6含有糖苷水解酶Glyco_hydro_3（紅色）和Glyco_hydro_3_C結(jié)構(gòu)域（黃色）；VdxyL4、VdxyL8和VdxyL12均含有糖苷水解酶Glyco_hydro_31結(jié)構(gòu)域（綠色）；其中VdxyL8還含有Gal_mutarotas_2結(jié)構(gòu)域（橙色）；VdxyL1、VdxyL2、VdxyL3、VdxyL5、VdxyL7、VdxyL9、VdxyL10、VdxyL11和VdxyL13均含有糖苷水解酶Glyco_hydro_43結(jié)構(gòu)域（藍色）；其中VdxyL3含有兩個Glyco_hydro_43結(jié)構(gòu)域。13個基因編碼的蛋白中VdxyL3、VdxyL6、VdxyL7、VdxyL9和VdxyL11含有不同長度的信號肽（黑色）（圖1）。

表2 大麗輪枝菌中木糖苷酶基因的鑒定

黑色表示信號肽；藍色表示Glyco_hydro 43結(jié)構(gòu)域；綠色表示Glyco_hydro 31結(jié)構(gòu)域；紅色表示Glyco_hydro 3結(jié)構(gòu)域；黃色表示Glyco_hydro 3_C結(jié)構(gòu)域；橙色表示Gal_mutarotas_2結(jié)構(gòu)域Black indicates the signal peptide; Blue indicates the Glyco_hydro 43 domain; Green indicates the Glyco_hydro 31 domain; Red indicates the Glyco_hydro 3 domain; Yellow indicates the Glyco_hydro 3_C domain; Orange indicates the Gal_mutarotas_2 domain

2.3 木糖苷酶基因多重序列比對及進化樹的構(gòu)建

通過在線軟件NCBI中多序列比對查找并選取其他物種中12個木糖苷酶基因編碼的蛋白序列，其中XP 018236340.1（尖鐮孢）、RMZ44074.1（黃曲霉）、TFL04453.1（細翼蕨）、TDZ59664.1（三葉炭疽菌）、TEA21443.1（紫蘇炭疽菌）和THX71209.1（出芽短梗霉菌）屬于糖苷水解酶43家族；CVK94262.1（芒果鐮孢）和CVL11996.1（層出鐮孢）屬于糖苷水解酶3家族；RKK75644.1（尖鐮孢）、KPM38392.1（新蜜環(huán)菌）、XP 003721488.1（稻瘟病菌）和XP 028469785.1（堿性鈉酵母菌）屬于糖苷水解酶31家族；將12個木糖苷酶基因與大麗輪枝菌13個木糖苷酶基因編碼的蛋白進行系統(tǒng)進化樹分析（圖2），25個蛋白被清晰地分成3組。VdxyL1、VdxyL2、VdxyL3、VdxyL5、VdxyL7、VdxyL9、VdxyL10、VdxyL11和VdxyL13與其他物種中43家族成員聚為一類；VdxyL6與其他物種中3家族成員聚為一類；VdxyL4、VdxyL12、VdxyL8與其他物種中31家族成員聚為一類；該結(jié)果與結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果一致，表明大麗輪枝菌13個木糖苷酶基因中，包括9個糖苷水解酶43家族成員，1個糖苷水解酶3家族成員和3個31家族成員。

紅色表示Glyco_hydro 3家族；紫色表示Glyco_hydro 31家族；藍色表示Glyco_hydro 43家族

2.4 木糖苷酶基因結(jié)構(gòu)分析

利用在線軟件GSDS對13個木糖苷酶基因結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果如圖3所示和含有5個外顯子和4個內(nèi)含子；含有4個外顯子和3個內(nèi)含子；、和含有3個外顯子和2個內(nèi)含子；、、、和含有2個外顯子和1個內(nèi)含子；和含有1個外顯子，無內(nèi)含子。

2.5 大麗輪枝菌木糖苷酶基因染色體分布

大麗輪枝菌共有8條染色體，13個木糖苷酶基因分布在6條染色體上。Chr02、Chr03和Chr07上分別含有3個木糖苷酶基因，Chr02上分布的基因為、和，Chr03上分布的基因為、和，Chr07上分布的基因為、和。Chr04上分布2個基因和。Chr01和Chr08上各含有一個木糖苷酶基因，分別為和（圖4）。根據(jù)200 kb核苷酸中含3個以上基因為1個基因簇的定義，木糖苷酶基因沒有形成基因簇。

圖3 大麗輪枝菌木糖苷酶基因結(jié)構(gòu)分析

圖4 大麗輪枝菌木糖苷酶基因在染色體上的分布

2.6 木糖苷酶基因在根系分泌物誘導(dǎo)下的表達分析

qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)6個基因均受到根系分泌物的誘導(dǎo)，在一種或多種根系分泌物中培養(yǎng)6 h或12 h后，表達量均明顯升高，然后降低。在海7124根系分泌物誘導(dǎo)6 h的表達量明顯高于其他樣本，表明該基因的表達明顯受海島棉根系分泌物的誘導(dǎo)。、、、和在耐病品種（中植棉2號）根系分泌物誘導(dǎo)6 h樣本中的表達量明顯高于其他樣本，其中的表達僅受到耐病品種根系分泌物的誘導(dǎo)，的表達也受感病陸地棉品種（新陸早8號）根系分泌物的誘導(dǎo)，、和受3種不同抗/感品種根系分泌物的誘導(dǎo)（圖5）。該研究結(jié)果表明大麗輪枝菌木糖苷酶基因在響應(yīng)棉花根系分泌物的過程中可能發(fā)揮著重要作用。根據(jù)qRT-PCR結(jié)果結(jié)合實驗室前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，選取用于進一步的功能研究。

圖5 木糖苷酶基因在不同棉花品種根系分泌物培養(yǎng)的大麗輪枝菌中表達模式

2.7 HIGS沉默效果檢測

選取進行HIGS沉默研究。將注射pTRV2-的棉花作為陰性對照，注射pTRV2-的棉花為陽性對照。注射10 d后，pTRV2-處理植株真葉出現(xiàn)黃化現(xiàn)象（圖6-A），表明HIGS體系可以成功抑制目標基因表達。制備濃度為1.0× 107cfu/mL大麗輪枝菌孢子懸浮液，采用傷根法侵染棉花。接菌14 d后，采集pTRV2-和pTRV2-處理的棉花莖，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以-F/R為引物，利用qRT-PCR分析的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pTRV2-處理的棉花莖中的表達量明顯低于pTRV2-（圖6-B），表明pTRV2-處理棉株中大麗輪枝菌的表達成功受到抑制。

A：注射pTRV2-GhCHLI 10 d后感病品種新陸早8號的表型Phenotypes ofsusceptible variety Xinluzao 8 after 10 days of injection with pTRV2-GhCHLI；B：qRT-PCR 檢測VdxyL3在pTRV2-00 和pTRV2-VdxyL3處理植株中的表達量。從接菌14 d后植株莖稈中提取棉花總RNA。tubulin為內(nèi)參基因qRT-PCR analysis of VdxyL3 expression in the pTRV2-00 and pTRV2-VdxyL3 treated plants. Total RNA was isolated from stems at 14 dpi. tubulin was used as the control

2.8 病情調(diào)查

接菌后14 d和21 d，分別對pTRV2-和pTRV2-處理植株的發(fā)病情況進行調(diào)查。接菌后14 d，pTRV2-處理植株出現(xiàn)輕微的葉片黃化現(xiàn)象，而pTRV2-處理植株呈現(xiàn)明顯的黃化和萎蔫現(xiàn)象；接菌后21 d，pTRV2-處理植株葉片出現(xiàn)明顯的黃化、萎蔫和脫落現(xiàn)象，而pTRV2-處理植株發(fā)病嚴重，葉片脫落較多（圖7-A）。兩種處理植株的正常生長均受到影響，但pTRV2-處理植株的株高略矮于pTRV2-處理植株（圖7-B）。病情指數(shù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)pTRV2-處理植株在接菌14 d和21 d的病情指數(shù)（33.3和83.9）均顯著高于pTRV2-植株14 d和21 d（21.7和66.1）（圖7-C）。剖桿試驗發(fā)現(xiàn)pTRV2-處理植株褐化程度明顯較高（圖7-D）。

2.9 大麗輪枝菌恢復(fù)培養(yǎng)和真菌相對生物量檢測

接菌后14 d，分別采集pTRV2-和pTRV2-處理棉株的莖，提取總DNA，利用qRT-PCR檢測真菌生物量。同時，收取pTRV2-和pTRV2-處理棉苗的莖用于大麗輪枝菌的恢復(fù)試驗。大麗輪枝菌恢復(fù)培養(yǎng)和真菌生物量檢測發(fā)現(xiàn)pTRV2-處理植株莖中的真菌生物量顯著多于pTRV2-處理植株（圖8-A、8-B），表明抑制的表達增強了大麗輪枝菌的致病力。

3 討論

木糖苷酶基因?qū)τ诮到庵参锛毎谥械哪揪厶侵陵P(guān)重要，篩選大麗輪枝菌致病相關(guān)木糖苷酶基因，可為防治由該菌引起的植物黃萎病提供理論依據(jù)。木糖苷酶基因?qū)儆谔擒账饷福╣lycoside hydrolases，GH）家族，該家族編碼的酶能夠以內(nèi)切或外切的方式水解含糖化合物中的糖苷鍵。根據(jù)CAZy數(shù)據(jù)庫依據(jù)氨基酸序列相似性對于糖苷水解家族的分類，共有168個公認的家族（GH1-168）。本研究從大麗輪枝菌中鑒定了13個木糖苷酶基因，它們分別屬于GH3、GH31和GH43家族。真菌的-木糖苷酶大都屬于GH3家族糖苷水解酶[24]。與前人研究不同，本研究13個基因中大多數(shù)（、、、、、、、和）屬于GH43家族，僅有1個（）屬于GH3家族。有的-木糖苷酶是雙功能酶，具有雙重酶催化活性[25-26]，本研究中和具有-木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶雙重酶活性，具有-葡糖苷酶/-木糖苷酶活性。-木糖苷酶在低聚木糖的末端還原端催化末端未經(jīng)取代的木糖甙水解，13個基因中包括3個-木糖苷酶基因（、和），均屬于GH31家族成員。

A：pTRV2-00和pTRV2-VdxyL3植株接種大麗輪枝菌14 d和21 d表型Disease symptom of the pTRV2-00 and pTRV2-VdxyL3 treated plants at 14 and 21 dpi；B：接種大麗輪枝菌14 d后pTRV2-00和pTRV2-VdxyL3處理植株的株高Plant height of the pTRV2-00 and pTRV2-VdxyL3 treated plants at 14 dpi；C：pTRV2-00和pTRV2-VdxyL3植株接種大麗輪枝菌14 d和 21 d病情指數(shù)統(tǒng)計Disease index of the pTRV2-00 and pTRV2-VdxyL3 treated plants at 14 and 21 dpi；D：pTRV2-00和pTRV2-VdxyL3植株接種大麗輪枝菌14 d后莖稈的表型Disease symptom in stems of the pTRV2-00 and pTRV2-VdxyL3 treated plants at 14 dpi

A：接種大麗輪枝菌14 d后pTRV2-00和pTRV2-VdxyL3處理植株莖稈中病原菌相對含量測定Quantification of the relative fungal biomass in stems of the pTRV2-00 and pTRV2-VdxyL3 treated plants at 14 dpi；B：接種大麗輪枝菌14 d后pTRV2-00和pTRV2-VdxyL3處理植株莖稈大麗輪枝菌恢復(fù)培養(yǎng)。將莖稈置于PDA培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后拍照Fungal isolation in the stem sections from pTRV2-00 and pTRV2-VdxyL3 treated plants at 14 dpi. Stems were plated on PDA medium. Photos were taken at 7 dpi of culture at 25℃

了解宿主與病原體的相互作用對于黃萎病的防控具有重要意義。在這個病理系統(tǒng)中，病害循環(huán)始于大麗輪枝菌微菌核對宿主根系分泌物刺激的響應(yīng)和萌發(fā)[27]。感病品種根系分泌物促進大麗輪枝菌的生長，而抗病品種根系分泌物抑制其生長[28-29]。EI-Bebany等[27]研究發(fā)現(xiàn)，感病馬鈴薯品種根系分泌物誘導(dǎo)后大麗輪枝菌中差異基因的數(shù)量多于中抗品種根系分泌物誘導(dǎo)后的數(shù)量，高侵染力病原菌中受感病品種根系分泌物誘導(dǎo)表達的基因被認為與致病相關(guān)；Zhang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，感病棉花品種根系分泌物誘導(dǎo)后大麗輪枝菌中差異基因的數(shù)量明顯多于耐病和抗病品種根系分泌物誘導(dǎo)后的數(shù)量，一些編碼水解酶和跨膜轉(zhuǎn)運蛋白的基因受感病品種根系分泌物誘導(dǎo)后明顯上調(diào)，被認為與致病相關(guān)；Xu等[9]研究表明，受棉花根誘導(dǎo)后表達量明顯上調(diào)，敲除和回補試驗發(fā)現(xiàn)該基因在大麗輪枝菌的產(chǎn)孢、菌絲體的發(fā)育、微菌核的形成和致病過程中發(fā)揮著重要作用，該基因HIGS沉默棉株的抗病性明顯增強。上述研究表明棉花根系分泌物能夠影響大麗輪枝菌中基因的表達，受其誘導(dǎo)表達的基因在大麗輪枝菌致病及宿主-病原體互作過程中可能發(fā)揮著重要的作用。本研究利用qRT-PCR對不同抗/感棉花品種根系分泌物誘導(dǎo)后大麗輪枝菌中6個木糖苷酶基因的表達量變化進行了分析，發(fā)現(xiàn)其表達均受根系分泌物的誘導(dǎo)，因此可將其作為研究大麗輪枝菌致病及宿主-病原體互作機制的候選基因。

大麗輪枝菌的致病分子機制非常復(fù)雜，近年來其致病相關(guān)基因的研究取得了階段性的進展。大麗輪枝菌致病相關(guān)基因包括效應(yīng)因子和細胞壁降解酶相關(guān)基因，如[30]、[8]、[31]和[32]等；生長-致病相關(guān)基因，如[33]、[34]、[35]和[36]等。盡管認為大麗輪枝菌分泌蛋白中的細胞壁降解酶能夠參與植物細胞壁的降解，促進病原菌的定殖，但相關(guān)基因的鑒定及功能研究僅有少量報道。如果膠代謝相關(guān)基因和被敲除后，大麗輪枝菌的致病力降低[37]。調(diào)控果膠酶和半乳糖酶活性的被敲除后，大麗輪枝菌的致病力降低[31]。毒力因子與植物細胞壁降解有關(guān)，該基因的缺失突變體致病力降低[32]。趙玉蘭等[38]利用HIGS技術(shù)快速篩選獲得了4個細胞壁降解相關(guān)基因，轉(zhuǎn)化4個靶標基因的煙草以及混合注射的煙草病情指數(shù)均降低，抗病性增強。上述研究表明將編碼細胞壁降解酶的基因敲除或沉默導(dǎo)致大麗輪枝菌的致病力降低。本研究利用HIGS技術(shù)沉默后大麗輪枝菌的致病力明顯增強，導(dǎo)致處理棉株的病情指數(shù)明顯增高，這與前人細胞壁降解酶基因的功能研究結(jié)果不一致[31-32,37-38]，推測可能參與誘導(dǎo)植物體內(nèi)的抗性機制，增強植株的抗性，而該基因的沉默表達導(dǎo)致植株抗病性減弱。鑒于大麗輪枝菌致病分子機制的復(fù)雜性，的具體作用機制有待進一步研究。

4 結(jié)論

利用生物信息學(xué)方法從大麗輪枝菌基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定出13個木糖苷酶基因，包括9個糖苷水解酶43家族成員，1個3家族成員和3個31家族成員。6個木糖苷酶基因的表達均受到棉花根系分泌物的誘導(dǎo)，暗示其在大麗輪枝菌致病及宿主-病原體互作過程中可能發(fā)揮著重要的作用。通過HIGS技術(shù)對木糖苷酶基因在大麗輪枝菌侵染過程中的功能進行分析，發(fā)現(xiàn)當被干擾后，轉(zhuǎn)化棉株的病情指數(shù)增高，抗病性減弱，表明與大麗輪枝菌的致病性相關(guān)。

[1] KLOSTERMAN S J, ATALLAH Z K, VALLAD G E, SUBBARAO K V. Diversity, pathogenicity, and management of Verticillium species. Annual Review of Phytopathology, 2009, 47: 39-62.

[2] 馬存, 簡桂良, 孫文姬. 我國棉花抗黃萎病育種現(xiàn)狀、問題及對策. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 1997, 30(2): 58-64.

MA C, JIAN G L, SUN W J. Current status, problem and countermeasure on resistance breeding to verticillium wilt of cotton in China. Scientia Agricultura Sinica, 1997, 30(2): 58-64. (in Chinese)

[3] 張緒振, 張樹琴, 陳吉棣, 李慶基, 陳壁, 姚躍文. 我國棉花黃萎病菌“種”的鑒定. 植物病理學(xué)報, 1981, 11(3): 13-20.

ZHANG X Z, ZHANG S Q, CHEN J D, LI Q J, CHEN B, YAO Y W. Identification of verticillium wilt pathogen of cotton in China. Acta Phytopathologica Sinica, 1981, 11(3): 13-20. (in Chinese)

[4] GERIK J S, HUISMAN O C. Study of field-grown cotton roots infected withusing an immunoenzymatic staining technique. Phytopathology, 1988, 78(9): 1174-1178.

[5] FRADIN E F, THOMMA B P H J. Physiology and molecular aspects of verticillium wilt diseases caused byand. Molecular Plant Pathology, 2006, 7(2): 71-86.

[6] GUI Y J, CHEN J Y, ZHANG D D, LI N Y, LI T G, ZHANG W Q, WANG X Y, SHORT D P, LI L, GUO W, KONG Z Q, BAO Y M, SUBBARAO K V, DAI X F.manipulates plant immunity by glycoside hydrolase 12 proteins in conjunction with carbohydrate-binding module 1. Environmental Microbiology, 2017, 19(5): 1914-1932.

[7] QIN J, WANG K L, SUN L F, XING H Y, WANG S, LI L, CHEN S, GUO H S, ZHANG J. The plant-specific transcription factors CBP60G and SARD1 are targeted by asecretory protein VDSCP41 to modulate immunity. eLife, 2018, 7: e34902.

[8] ZHANG L S, NI H, DU X, WANG S, MA X W, NRNBERGER T, GUO H S, HUA C L. The-specific protein VdSCP7 localizes to the plant nucleus and modulates immunity to fungal infections. New Phytologist, 2017, 215(1): 368-381.

[9] XU J, WANG X Y, LI Y Q, ZENG J G, WANG G L, DENG C Y, GUO W Z. Host-induced gene silencing of a regulator of G protein signaling gene () confers resistance to verticillium wilt in cotton. Plant Biotechnology Journal, 2018, 16(9): 1629-1643.

[10] ZHAO Y L, ZHANG T, GUO H S. Penetration assays, fungal recovery and pathogenicity assays for. Bio-Protocol, 2017, 7(4): DOI: 10.21769/BioProtoc.2133.

[11] HOGENHOUT S A, VAN DER HOORN R A, TERAUCHI R, KAMOUN S. Emerging concepts in effector biology of plant- associated organisms. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2009, 22(2): 115-122.

[12] 張志東. 棉花黃萎病致病相關(guān)基因的挖掘與功能分析[D] . 上海: 上海交通大學(xué), 2017.

ZHANG Z D. Mining and function analysis of genes related to cotton verticillium wilt[D]. Shanghai: Shanghai jiaotonguniversity, 2017. (in Chinese)

[13] HUANG X L, LI Z, DU C Y, WANG J F, LI S. Improved expression and characterization of a multidomain xylanase fromSCUT27 in. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2015, 63(28): 6430-6439.

[14] ZHANG S Y, WANG H M, SHI P J, XU B, BAI Y G, LUO H Y, YAO B. Cloning, expression, and characterization of a thermostable-xylosidase from thermoacidophilicsp. A4. Process Biochemistry, 2014, 49(9): 1422-1428.

[15] NGUYEN Q B, ITOH K, VU B V, TOSA Y, NAKAYASHIKI H. Simultaneous silencing of endo--1,4 xylanase genes reveals their roles in the virulence of. Molecular Microbiology, 2011,81(4):1008-1019.

[16] BritoN, Espino J J, GonzálezC. The endo--1,4-xylanase Xyn11A is required for virulence in. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2006, 19(1):25-32.

[17] MUSSATTO S I, MANCILHA I M. Non-digestible oligosaccharides: A review. Carbohydrate Polymers, 2007, 68(3): 587-597.

[18] VAN RENSBURG P, STRAUSS M L A, LAMBRECHTS M G, CORDERO OTERO R R, PRETORIU I S. The heterologous expression of polysaccharidase-encoding genes with oenological relevance in. Journal of Applied Microbiology, 2007, 103(6): 2248-2257.

[19] BOSETTO A, JUSTO P I, ZANARDI B, VENZON S S, GRACIANO L, DOS SANTOS E L, DE CASSIA GARCIA SIMAO R. Research progress concerning fungal and bacterial-xylosidases. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2016, 178(4): 766-795.

[20] MUSTAFA G, KOUSAR S, RAJOKA M I, JAMIL A. Molecular cloning and comparative sequence analysis of fungal-xylosidases. AMB Express, 2016, 6(1): 30.

[21] ZHANG X Y, CHENG W H, FENG Z D, ZHU Q H, SUN Y Q, LI Y J, SUN J. Transcriptomic analysis of gene expression ofupon treatment of the cotton root exudates. BMC Genomics, 2020, 21(1): 155.

[22] 熊顯鵬.和在棉花抗黃萎病中的功能研究[D]. 石河子: 石河子大學(xué), 2020.

XIONG X P. Functional analysis ofand

[23] ELLENDORFF U, FRADIN E F, DE JONGE R, THOMMA B P. RNA silencing is required fordefence against verticillium wilt disease.Journal of Experimental Botany, 2009, 60(2): 591-602.

[24] YANG X Z, SHI P J, HUANG H Q, LUO H Y, WANG Y R, ZHANG W, YAO B. Two xylose-tolerant GH43 bifunctional-xylosidase/-arabinosidases and one GH11 xylanase fromand their synergy in the degradation of xylan. Food Chemistry, 2014, 148: 381-387.

[25] JORDAN D B, LI X L. Variation in relative substrate specificity of bifunctional-d-xylosidase/-l-arabinofuranosidase by single-site mutations: roles of substrate distortion and recognition. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics, 2007, 1774(9): 1192-1198.

[26] LEE R C, HRMOVA M, BURTON R A, LAHNSTEIN J, FINCHER G B. Bifunctional family 3 glycoside hydrolases from barley with-l-arabinofuranosidase and-D-xylosidase activity. Journal of Biological Chemistry, 2003, 278(7): 5377-5387.

[27] El-BEBANY A F, HENRIQUEZ M A, BADAWI M, ADAM L R, HADRAMI A E, DAAYF F. Induction of putative pathogenicity- related genes inin response to elicitation with potato root extracts. Environmental and Experimental Botany, 2011, 72(2):251-257.

[28] 袁虹霞, 李洪連, 王燁, 房衛(wèi)平, 王振躍. 棉花不同抗性品種根系分泌物分析及其對黃萎病菌的影響. 植物病理學(xué)報, 2002, 32(2): 127-131.

YUAN H X, LI H L, WANG Y, FANG W P, WANG Z Y. The root exudates of cotton cultivars with the different resistance and their effects on. Acta Phytopathologica Sinica, 2002, 32(2): 127-131. (in Chinese)

[29] 鄭倩, 李俊華, 危常州, 褚貴新. 不同抗性棉花品種根系分泌物及酚酸類物質(zhì)對黃萎病菌的影響. 棉花學(xué)報, 2012, 24(4): 363-369.

ZHENG Q, LI J H, WEI C Z, CHU G X. Effects of root exudates and phenolic acids from differently resistant cotton cultivars on. Cotton Science, 2012, 24(4): 363-369. (in Chinese)

[30] KOMBRINK A, ROVENICH H, SHI-KUNNE X, ROJAS-PADILLA E, DOMAZAKIS E, VAN DEN BERG G C M, Domazakis E, DE JONGE R, VALKENBURG D J, SANCHEZ-VALLET A, SEIDL M F, THOMMA B P H J.LysM effectors differentially contribute to virulence on plant hosts. Molecular Plant Pathology, 2017, 18(4): 596-608.

[31] TZIMA A K, PAPLOMATAS E J, RAUYAREE P, OSPINA- GIRALDO M D, KANG S., the sucrose non-fermenting protein kinase gene of, is required for virulence and expression of genes involved in cell-wall degradation. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2011, 24(1): 129-142.

[32] LIU S Y, CHEN J Y, WANG J L, LI L, XIAO H L, ADAM S M, DAI X F. Molecular characterization and functional analysis of a specific secreted protein from highly virulent defoliating. Gene, 2013, 529(2): 307-316.

[33] SANTHANAM P, THOMMA B P.Sge1 differentially regulates expression of candidate effector genes. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2013, 26(2): 249-256.

[34] LI Z F, LIU Y J, FENG Z L, FENG H J, KLOSTERMAN S J, ZHOU F F, ZHAO L H, SHI Y Q, ZHU H Q., encoding CYC8 glucose repression mediator protein, is required for microsclerotia formation and full virulence in. PLoS One, 2015, 10(12): e0144020.

[35] ZHANG Y L, LI Z F, FENG Z L, FENG H J, SHI Y Q, ZHAO L H, ZHANG X L, ZHU H Q. Functional analysis of the pathogenicity- related gene. PLoS One, 2016, 11(11): e0166000.

[36] QI X L, SU X F, GUO H M, QI J C, CHENG H M. VdThit, a thiamine transport protein, is required for pathogenicity of the vascular pathogen. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2016, 29(7): 545-559.

[37] CHEN J Y, XIAO H L, GUI Y J, ZHANG D D, LI L, BAO Y M, DAI X F. Characterization of theexoproteome involves in pathogenicity from cotton-containing medium. Frontiers in Microbiology, 2016, 7: 1709.

[38] 趙玉蘭, 蘇曉峰, 程紅梅. 利用寄主誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)驗證大麗輪枝菌糖代謝相關(guān)基因的致病力. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48(7): 1321-1329.

ZHAO Y L, SU X F, CHENG H M. Verification ofpathogenicity of glycometabolism related genes by using host-induced gene silencing method. Scientia Agricultura Sinica, 2015, 48(7): 1321-1329. (in Chinese)

Identification of Xylosidase Genes fromand Functional Analysis Based on HIGS Technology

ZHANG XiaoXue, SUN TianGe, ZHANG YingChun, CHEN LiHua, ZHANG XinYu, LI YanJun, SUN Jie

College of Agriculture, Shihezi University, Shihezi 832003, Xinjiang

【】The objective of this research is to identify xylosidase genes fromand study the relationship between xylosidase genes and pathogenicity of, which will provide a theoretical basis for exploring the molecular mechanism of pathogenicity ofand a scientific basis for formulating better control strategies for verticillium wilt.【】All xylosidase genes were identified from the genome database ofby bioinformatics, and their protein domain, chromosomal location and phylogenetic relationship were analyzed. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) was used to detect the expression pattern of xylosidase genes inculturedwith different root exudates from resistant and susceptible cotton varieties for 0, 6, 12, 24 and 48 h. The function of one of the xylosidase geneswas analyzed by using host-induced gene silencing (HIGS) method. The target fragment ofwas injected into cotton, and thenVd991 was inoculated to those plants injected with target fragment ofby using root-dip approach. The phenotype of transformed plants was observed and the disease index was counted, meanwhile, the biomass of fungi and the expression level of【】Bioinformatics analysis showed that there were 13 xylosidase genes (-) in, whose coding sequences ranged from 1 461 to 2 544 bp, molecular weight of the encoded proteins ranged from 38.78 to 90.97 kD, and theoretical isoelectric point ranged from 4.67 to 5.89. Protein domain phylogenetic relationship analysis showed that there were 9 glycoside hydrolase 43 family members, 1 glycoside hydrolase 3 family member and 3 glycoside hydrolase 31 family members included in xylosidase genes. The chromosomal location analysis showed that the 13 genes were distributed on 6 chromosomes and no gene clusters were formed. qRT-PCR analysis showed that the expression of 6 xylosidase genes was induced by cotton root exudates. After being cultured in one or more root exudates for 6 h or 12 h, expression levels of these genes were significantly increased and then decreased. Among 6 genes, the expression level ofincreased significantly after sensing root exudates from sea island cotton. The results based on HIGS technology showed that after 14 and 21 days of inoculation, the disease symptom of cotton plants transformed withinterfering fragment was more serious, and the disease index (33.3 and 83.9) was significantly higher than that of empty vector control (21.7 and 66.1). qRT-PCR analysis showed that cotton plants transformed withinterfering fragment had higher fungal biomass but lower expression level ofcompared to the empty vector control.【】Thegene silencing by using HIGS technology lead to a significant decrease of cotton resistance to, indicating thatmay play a certain role in the pathogenesis ofand host-pathogen interaction.

cotton;; verticillium wilt;; xylosidase; host-induced gene silencing (HIGS)

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.15.007

2020-11-09；

2020-12-18

國家自然科學(xué)基金（31460360）、石河子大學(xué)高層次人才科研啟動項目（RCZK202019）

張小雪，E-mail：943124507@qq.com。通信作者李艷軍，E-mail：lyj20022002@sina.com

（責任編輯 岳梅）