吳燕瑜，齊俊南

江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006

銀屑病是一種以斑塊、鱗屑為主要表現(xiàn)的慢性皮膚病，其主要發(fā)病機制為表皮的過度增厚及免疫反應(yīng)［1］。本病主要分為尋常型、關(guān)節(jié)型、膿皰型、紅皮型四型，而尋常型銀屑病發(fā)病率占90%以上［2］。近年來，隨著中成藥的應(yīng)用，不僅拓寬了治療銀屑病的思路，也使銀屑病的治療效果得到了提高。丹紅注射液是丹參和紅花的提取物［3］，據(jù)中醫(yī)理論，丹參和紅花在活血化瘀通絡(luò)方面是相須為用的，二者聯(lián)合應(yīng)用加強了活血化瘀的作用，因此，丹紅注射液廣泛應(yīng)用于心腦血管等疾病［4-6］。針對其涼血活血的功效，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學探究丹紅注射液治療銀屑病的作用機制。

1 方法

1.1 藥物成分檢索及收集

通過使用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫及分析平臺（TCMSP，http://tcmspw.com/index.php）分別檢索“丹參”“紅花”，設(shè)定閾值為OB（口服生物利用度）≥30%，DL（化合物類藥性）≥0.18，篩選并收集兩個藥物的有效成分。

1.2 活性化合物標靶蛋白的篩選

使用PubChem 有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查找活性化合物的2D結(jié)構(gòu)圖，將化合物的2D 結(jié)構(gòu)圖導入Swisstargetprediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）進行靶標蛋白檢索，物種選擇為智人（Homo sapiens）。

1.3 疾病靶點的篩選

使用Gencards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）等數(shù)據(jù)庫，以“psoriasis”為關(guān)鍵詞進行檢索，檢索銀屑病的相關(guān)基因。

1.4 基因名稱的標準化以及化合物-基因靶點的網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

使用Uniprot（https://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫查詢靶標基因的標準化名稱，將藥物化合物、靶標基因?qū)隿ytoscape 3.8.0 軟件中構(gòu)建藥物-化合物-基因靶點網(wǎng)絡(luò)圖，并分析化合物與靶點之間的度值。

1.5 交集基因的篩選及其蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將丹參和紅花的基因靶點和銀屑病的基因靶點輸入在線作圖工具（venny 2.1，https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）查找藥物化合物與銀屑病的交集基因。將得到的核心蛋白基因?qū)氲絪tring 在線作圖軟件，獲取蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 核心靶點的通路分析

把選定的丹參、紅花對治療銀屑病的核心靶基因?qū)?DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/），對所有靶基因進行官方名稱（official gene symbol）校正；設(shè)定清單類型為基因列表（Gene List），物種設(shè)置為智人（Homo sapiens）。對BP（Biological process）生物學過程進行富集分析，在 Pathways 模塊中進行基于京都基因與基因百科全書（KEGG）代謝通路富集分析，設(shè)定閾值為P＜0.05。并將數(shù)據(jù)導入繪圖網(wǎng)站 Omishare Tools（http：//www.omicshare.com/tools/Home/Index/index.html）將數(shù)據(jù)結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性化合物的篩選

從TCMSP 平臺中檢索丹參、紅花共得到化合物113 個（丹參202 個、紅花189 個）化合物，經(jīng)過篩選后得到有效活性化合物87 個，通過檢索這87 個活性成分的蛋白靶點，將數(shù)據(jù)導入cytoscape 3.8.0 軟件中使用network analysis 工具進行度值計算，選取degree 值≥9 的共46 個活性成分進行分析。詳見表1。

表1 丹紅注射液活性成分表

2.2 藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將篩選出的46 個活性化合物（其中有兩個未獲取到基因靶點），整理得到基因靶點共228 個，利用Cytoscape 軟件構(gòu)建丹紅注射液藥物-成分-靶點圖，共有節(jié)點275 個，共1 223 個相互作用關(guān)系，見圖1。篩選出前5 的化合物為quercetin（槲皮素）、luteolin（木犀草素）、kaempferol（山柰酚）、tanshinone iia（丹參酮iia）、salviolone（丹參酮），前五的靶點為PTSG2、ADRB2、SCN5A、PTSG1、CHRM3。詳見表2，3。

圖1 藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

表2 藥物的degree值前5的活性成分

表3 藥物的degree值前5的作用靶點

2.3 疾病靶點的篩選

在 GeneCards 數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫以“psoriasis”為關(guān)鍵詞，篩選銀屑病相關(guān)的疾病靶點基因信息，去重后共收集到銀屑病靶點基因3 753 個。

2.4 獲取藥物與疾病的交集基因

將丹紅注射液的228 個靶點和銀屑病的3 753個靶點輸入Venny 2.1 在線軟件作圖工具平臺繪制韋恩圖，兩者交集為疾病-類藥活性成分共同靶點，共132 個，見圖2。

圖2 銀屑膠囊和銀屑病共同基因靶點

2.5 丹紅注射液與銀屑病的蛋白互作PPI 圖

將核心基因?qū)雜tring 數(shù)據(jù)庫中，選擇物種為智人，最低交叉互作分數(shù)設(shè)置為0.9，得到蛋白互作PPI圖共有132 個點，659 條邊，平均度值為9.98，點越大，連接線條越粗，表明互作關(guān)系越多，見圖3。主要的蛋白基因是STAT3、AKT1、JUN、TP53 等，見圖4。

圖3 核心基因蛋白PPI互作圖

圖4 通過string數(shù)據(jù)庫分析degree值前20的基因靶點柱狀圖

2.6 核心基因標靶的富集分析

將交集基因?qū)隓VID 數(shù)據(jù)庫中，進行關(guān)于BP、CC、MF 和KEGG Pathways 生物過程的富集分析中，按照頻率排序，篩選出前20 個關(guān)于GO 富集分析，主要是作用于細胞的組成，見圖5。并根據(jù)通路上基因的數(shù)量對KEGG Pathways 進行排序，發(fā)現(xiàn)銀屑病與癌癥、乙肝、丙肝都有一定的聯(lián)系，丹紅注射液治療銀屑病主要通過PI3K-Akt、TNF、MAPK、HIF-1 等信號通路。見圖5。

圖5 GO富集分析生物過程柱狀圖

2.7 KEGG pathway 分析

將核心基因?qū)隟EGG 數(shù)據(jù)庫中進行分析，其中在PI3K-Akt 信號通路上共有32 個基因，主要集中在該通路的下游基因。對于銀屑病現(xiàn)在比較熱門的TH17 細胞分化通路上，一共有22 個基因，主要表現(xiàn)為上游基因進行調(diào)控，通過IL-1β、TGF-β、IL-6、IFN-γ、IL-2、IL-4 等因子進行調(diào)控下游蛋白進而調(diào)節(jié)TH17 細胞的分化。詳見圖7，8。

圖7 PI3K-Akt信號通路圖

3 討論

圖6 KEGG pathway富集分析氣泡圖

中醫(yī)學稱銀屑病為“白疕病”，是一個難治性、易復發(fā)的疾病，《醫(yī)林改錯》云:“血受熱則煎熬成塊?！标U述了銀屑病患者初起血熱為主，熱邪煎熬血液導致血瘀?！端貑枴け哉撈吩?“病久入深，榮衛(wèi)之行澀，經(jīng)絡(luò)時疏，故不通。”表明了久病則氣滯血瘀，經(jīng)絡(luò)堵塞，形成血瘀。其中斑塊狀銀屑病患者表現(xiàn)為皮膚甲錯，瘙癢不適，皮疹暗紅色，為血瘀的表現(xiàn)。莊國康提出“肥厚是瘀、色紅是熱”的辨證要點［7］。趙炳南認為本病夏輕冬重明顯的季節(jié)性，主要是因為寒燥閉阻肌膚，瘀毒不得化，風邪不能散而形成的［8］。禤國維從燥毒瘀論治本?。?］，徐宜厚將銀屑病的病理過程歸納為血熱—血燥—血瘀，認為血瘀為其病理轉(zhuǎn)化的主軸［10］?？梢娧鲎C在銀屑病的發(fā)病過程中具有重要的作用。丹紅注射液由丹參、紅花2 味藥物組成，具有涼血活血的作用。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學分析可以發(fā)現(xiàn)丹紅注射液通過多個基因靶點、多條通路進行作用治療銀屑病。

丹紅注射液中重要的成分是：槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山柰酚（kaempferol）、丹參酮iia（tanshinone iia）、丹參酮（salviolone）。槲皮素可以通過NF-κB 途徑改善銀屑小鼠模型皮炎反應(yīng)［11］，同時還可以降低炎癥因子IL-6 和TNF-α 的表達［12-13］，木犀草素可通過減少INF-γ 的分泌，抑制外周血TH1 和TH17 的增加，減輕銀屑病的皮損和炎癥反應(yīng)［14］。同時，木犀草素還可以抑制銀屑病角質(zhì)細胞增殖［15］。在使用ImQ 誘導的銀屑病小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)山柰酚可以降低銀屑病皮損的CD3+T 細胞的浸潤，降低IL-6、IL-17A、TNF-α的基因表達，并下調(diào)了NF-κB 信號［16］。丹參酮IIA 可以誘導銀屑病靶細胞角質(zhì)形成、細胞周期阻滯和凋亡的細胞機制［17］,還可以降低脂質(zhì)過氧化物的含量,具有抵抗氧自由基和調(diào)節(jié)免疫等作用［18］，能夠治療銀屑病。丹參酮可抑制抗原淋巴結(jié)細胞和激活的巨噬細胞產(chǎn)生IFN-Y 和IL-12［19］,還可以抑制肥大細胞脫顆粒，減少炎癥反應(yīng)［20］。

圖8 TH17 細胞分化信號通路圖

藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)藥物主要是通過作用于PTSG2、ADRB2、SCN5A、PTSG1、CHRM3進行作用。PTGS2 又稱（COX-2）環(huán)氧化酶-2，COX-2 可促進細胞增殖、抑制細胞凋亡［21］，同時COX-2 還是HIF-1 的下游基因，協(xié)同促進角質(zhì)細胞增殖并出現(xiàn)表皮角化不全，棘層肥厚和真皮乳頭毛細血管增生［22］，表現(xiàn)為銀屑病的組織病理變化。通過DAVID 數(shù)據(jù)庫分析，發(fā)現(xiàn)丹紅注射液主要通過PI3K-Akt、FoXO、TNF、MAPK、HIF-1 等信號通路對銀屑病進行作用。PI3K/Akt 信號轉(zhuǎn)導通路是細胞存活的重要通路［23］，銀屑病皮損中PI3K 基因及其亞單位PI3K-P110 蛋白的表達特異性增高［24］，Akt 的高表達可導致下游的FoxO 蛋白磷酸化水平升高，進而作用于下游的細胞周期調(diào)控蛋白Cyclin和CDK，使角質(zhì)細胞出現(xiàn)過度增殖的病理變化［25］。同時PI3K-Akt 還可以下調(diào)靶蛋白mTOR，高度活化的PI3K/Akt/mTORC1 可抑制角質(zhì)形成細胞的細胞核自噬功能，導致表皮出現(xiàn)角化不全的病理變化［26］。通過MAPK 信號通路可以抑制NF-κB 和AP-1 的磷酸化，發(fā)揮抗炎作用［27］，也是連接細胞對外界刺激反應(yīng)的重要信號轉(zhuǎn)導通路［28］。

綜上所述，丹參注射液治療銀屑病具有多靶點、多通路作用，為研究丹參注射液治療銀屑病的作用機理提供了思路。但網(wǎng)絡(luò)藥理學僅僅是理論上的探討，還需通過實驗進行驗證。