吳亞娟，趙 楠，錢科佳，惠 濤，潘繼英

（張家港市第四人民醫(yī)院精神科，江蘇 張家港 215600）

目前精神分裂癥（schizophrenia）病因尚不清楚，通過現(xiàn)象學(xué)方法無法辨別因果關(guān)系，而有關(guān)基因功能和遺傳變異的研究對闡明精神分裂癥的病因機(jī)制和了解環(huán)境因素對精神分裂癥的影響都具有重大意義[1]。近十年來精神分裂癥的全基因關(guān)聯(lián)研究改變了精神病學(xué)的研究領(lǐng)域，表明了在分子水平上精神分裂癥具有潛在的生物學(xué)基礎(chǔ)[2]。用人類多能干細(xì)胞和含有風(fēng)險相關(guān)變體的基因組細(xì)胞建立精神分裂癥患者的神經(jīng)元模型正在開展[3]。以基因?yàn)榍腥朦c(diǎn)，研究精神分裂癥風(fēng)險相關(guān)的基因或可構(gòu)建觀察和治療目標(biāo)的系統(tǒng)模塊。然而，目前有文獻(xiàn)報道的精神分裂癥風(fēng)險基因很多，彼此缺乏系統(tǒng)聯(lián)系?；诖?，本研究采用生物信息學(xué)方法對精神分裂癥編碼基因進(jìn)行分析，以期尋找更為精準(zhǔn)的候選基因。

1 資料與方法

1.1 資料來源 于大鼠基因組數(shù)據(jù)庫（https://rgd.mcw.edu/wg/，RGD）中搜集人源精神分裂癥編碼基因。

1.2 方法

1.2.1 精神分裂癥編碼基因的獲取 在RGD 數(shù)據(jù)庫檢索“schizophrenia”，在Results Matrix 中選擇human 下的gene 及protein-coding，即獲取人源精神分裂癥的編碼基因，檢索獲得391 條基因信息。

1.2.2 基因本體功能注釋（GO）使用在線基因注釋軟件（https://david.ncifcrf.gov/）對精神分裂癥相關(guān)編碼的391 個基因進(jìn)行GO 功能富集分析，以P＜0.05為篩選條件，從生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）三方面對391 個基因最可能涉及到的功能進(jìn)行篩選，將結(jié)果以txt 文本格式保存，后利用R 軟件作圖。

1.2.3 京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集析 使用在線基因注釋軟件（https://david.ncifcrf.gov/）對391 個基因進(jìn)行KEGG 通路富集分析，以P＜0.05 為篩選條件，篩選最可能涉及到的通路，將結(jié)果以txt 文本格式保存，后利用R 軟件作圖。

1.2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 使用在線軟件（https://string-db.org/）對391 個基因構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，預(yù)測編碼蛋白間的相互作用，將391 個基因以基因列表的形式上傳網(wǎng)站，后點(diǎn)擊左欄multiple proteins 按鈕，將篩選條件設(shè)置為combined score 即相互作用分?jǐn)?shù)大于0.7，導(dǎo)出結(jié)果以TSV 格式保存。

1.2.5 關(guān)鍵基因的篩選 將String 網(wǎng)站下載的結(jié)果TSV 文件導(dǎo)入到cytoscape 軟件（3.6 版本），利用插件Mcode 篩選關(guān)鍵模塊，以cytohubba 插件篩選熱點(diǎn)基因，為提高篩選的可靠性，取用cytohubba 中的degree、mcc、mnc3 種算法分別計(jì)算排名前10 位的熱點(diǎn)基因，然后取交集，結(jié)合這些候選基因是否處在關(guān)鍵模塊中，最終篩選出關(guān)鍵基因。

2 結(jié)果

2.1 GO 分析結(jié)果 BP 生物學(xué)過程功能富集分析結(jié)果顯示，GO:0033141～富集于STAT 蛋白磷酸化修飾的基因數(shù)量有10 個，GO:0002323～富集于免疫反應(yīng)中自然殺傷細(xì)胞活化的基因數(shù)量有10 個，GO:0002286～富集于免疫反應(yīng)中T 細(xì)胞活化的基因數(shù)量有10 個，見圖1。MF 分子功能富集分析結(jié)果顯示，GO:0005132～參與Ⅰ型干擾素受體結(jié)合的基因數(shù)量有10 個，GO:0005125～參與細(xì)胞因子活化的基因數(shù)量有12 個，GO:0005234～參與谷氨酸門控離子通道活化的基因數(shù)量有5 個，見圖2。CC 細(xì)胞組分功能富集分析結(jié)果顯示，GO:0030054～富集于細(xì)胞連接處的基因數(shù)量有23 個，GO:0045211～富集于突觸后膜上的基因數(shù)量有15 個，GO:0030424～富集于軸突的基因數(shù)量有14 個，見圖3。

圖1 生物學(xué)過程功能富集結(jié)果

圖2 分子功能富集結(jié)果

圖3 細(xì)胞組成富集結(jié)果

2.2 KEGG 通路富集分析結(jié)果 391 個基因主要富集通路包括：hsa04623：細(xì)胞質(zhì)DNA 感覺通路，富集于其上的基因數(shù)量有12 個；hsa04622：RLR 信號通路，富集于其上的基因數(shù)量有10 個；hsa05320：自身免疫甲狀腺疾病，富集于其上的基因數(shù)量有9 個，見圖4。

圖4 KEGG 功能富集結(jié)果

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 364 個蛋白發(fā)生相互作用，平均節(jié)點(diǎn)分?jǐn)?shù)0.852，刪除聯(lián)系較少的節(jié)點(diǎn)，其中156 蛋白之間聯(lián)系程度緊密，見圖5。

圖5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 關(guān)鍵模塊及關(guān)鍵基因 關(guān)鍵模塊中包含11 個基因，分別為TAAR6、DRD2、DRD4、CHRNA7、ZNF804A、DTNBP1、POX2、NRG1、DAO、DISC1、ZDHHC8，其中ZDHHC8 為種子基因，見圖6。結(jié)合cytohubba 的三種算法，最終獲取6 個關(guān)鍵基因，分別為DTNBP1、DAO、DRD2、DISC1、NRG1、ZDHHC8。

圖6 關(guān)鍵基因模塊圖

3 討論

目前認(rèn)為與精神分裂癥發(fā)生密切相關(guān)的各種因素中，遺傳因素是最具影響力的，得到較多生物學(xué)證據(jù)支持[4]。此外，在精神分裂癥的成因中有一些經(jīng)典假說，包括多巴胺假說、谷氨酸生化假說、神經(jīng)發(fā)育假說。對精神分裂癥生物標(biāo)志物的研究也大都圍繞這些假說開展。本研究發(fā)現(xiàn)精神分裂癥的病理過程或有免疫因素參與，對精神分裂癥編碼基因的GO分析發(fā)現(xiàn)，大部分基因與免疫反應(yīng)密切相關(guān)，包括以自然殺傷細(xì)胞為代表的先天免疫和以T 細(xì)胞為代表的適應(yīng)性免疫。最近有研究指出，精神分裂癥的病因與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)紊亂密切相關(guān)，免疫過程在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)、恢復(fù)力和腦儲備中起著至關(guān)重要的作用[5]。除此以外，有研究指出利用免疫系統(tǒng)治療或可改善大腦健康，T 細(xì)胞分泌IL-4，而IL-4 能刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞因子釋放，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞和炎性巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使神經(jīng)炎性M1 表型向保護(hù)性神經(jīng)元M2 模式轉(zhuǎn)換[6]。本研究還發(fā)現(xiàn)這些基因的分子功能大多涉及到細(xì)胞因子的活化。Moriss G 等[7]研究表明，活化的細(xì)胞因子作為炎癥反應(yīng)的一部分，可以改變5-羥色胺、多巴胺、谷氨酸等神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和重攝取。近年來，免疫炎癥假說也持續(xù)受到關(guān)注，來自于臨床及臨床前研究等多項(xiàng)證據(jù)提示，精神分裂癥患者血清白細(xì)胞介素家族中多種因子、γ-干擾素（IFN-γ）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）等促炎性細(xì)胞因子水平發(fā)生改變[8]。此外，本研究對這些基因的通路富集結(jié)果還發(fā)現(xiàn)TOLL 樣受體（TLRs）信號通路似乎在精神分裂癥中扮演著重要作用。TLRs主要參與固有免疫的調(diào)節(jié)，研究發(fā)現(xiàn)在精神分裂癥早期階段即可出現(xiàn)TLR 表達(dá)異常，并且TLRs 可影響認(rèn)知功能[9，10]。最近關(guān)于抑郁和TLR 的動物研究發(fā)現(xiàn)[11]，選擇性地阻斷TLR2/4 在小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，會抑制小鼠的抑郁行為。這些研究說明TOLL 樣受體信號通路參與精神疾病的病理過程，但其究竟如何影響精神疾病的發(fā)展還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

本研究進(jìn)一步對391 個編碼基因進(jìn)行蛋白互作分析，篩選精神分裂癥相關(guān)的關(guān)鍵基因，發(fā)現(xiàn)DTNBP1、DAO、DRD2、DISC1、NRG1、ZDHHC8 與 精神分裂癥具有較高的相關(guān)性，其中DRD2 和DISC1是目前公認(rèn)的精神分裂癥的易感基因[12，13]。本研究發(fā)現(xiàn)NRG1 也和精神分裂癥密切相關(guān)，與文獻(xiàn)結(jié)果相一致，最近研究發(fā)現(xiàn)NRG1 基因表達(dá)水平與精神疾病患病風(fēng)險有關(guān)[14]，李婷等[15]則發(fā)現(xiàn)首發(fā)精神分裂癥患者血清NRG1 與認(rèn)知功能相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)DAO 基因也是參與精神分裂癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因，有文獻(xiàn)報道DAO 基因編碼的D-氨基酸氧化酶在精神分裂癥的病理機(jī)制中發(fā)揮作用[16]，并且其基因型與精神分裂癥及神經(jīng)認(rèn)知缺陷相關(guān)[17]，而目前研究不足以突出DAO 對精神分裂癥的重要性，顯然后續(xù)需要對DAO 基因進(jìn)行更深入的研究。目前對于本研究結(jié)果中的DPNBP1 基因和精神分裂癥關(guān)系文獻(xiàn)報道還比較少，但已有文獻(xiàn)支持DPNBP1 與精神分裂癥患者背外側(cè)前額葉皮層樹突形成有關(guān)，并且其基因多態(tài)性與持續(xù)注意和固定轉(zhuǎn)移有關(guān)[18，19]。另外本研究發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵模塊中的ZDHHC8 是種子基因，與其他的編碼蛋白都能產(chǎn)生相互作用。然而，現(xiàn)有對ZDHHC8 的研究只能證實(shí)它與精神分裂癥患者皮質(zhì)體積有關(guān)[20]，針對巴西人的研究發(fā)現(xiàn)它與精神分裂癥易感基因有關(guān)[21]。早年有報道ZDHHC8 單核苷酸多態(tài)性rs175174 與22q11 缺失綜合征或精神分裂癥的精神病學(xué)特征無關(guān)[22]，這或許導(dǎo)致后來研究未再對ZDHHC8 引起重視。結(jié)合本研究結(jié)果，推測ZDHHC8 可能是通過與精神分裂癥其他易感基因發(fā)生作用，但對此推論需要后續(xù)更多的證據(jù)支持。

綜上所述，免疫炎癥反應(yīng)和精神分裂癥的病理機(jī)制密切相關(guān)，其中TOLL 樣受體信號通路和NRG1 信號通路值得關(guān)注，而關(guān)鍵基因DTNBP1 和ZDHHC8 與精神分裂癥的直接關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。