王 輝 李小麗 張慶軍

重癥肺炎誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可誘導(dǎo)機體多器官功能衰竭，重癥肺炎也是重癥患者死亡的常見原因[1]。研究顯示，細(xì)菌、病毒等病原微生物可誘導(dǎo)肺組織中產(chǎn)生大量炎性因子、細(xì)胞因子，這些調(diào)控因子可以激發(fā)肺組織內(nèi)免疫反應(yīng)異常、抗炎因子失衡等，進而介導(dǎo)肺實質(zhì)炎癥發(fā)生[2]。肺炎克雷伯菌是常見的機會致病菌，其可以引起肺組織感染，誘發(fā)重癥肺炎[1]。中藥治療肺炎歷史悠久，其毒副作用小、安全性高[3]。紅景天苷是從藏藥紅景天中提取出來的活性成分，有很多藥理學(xué)作用，如降血壓、提高免疫力、抗氧化、消炎等，臨床上可用于治療冠心病、糖尿病等疾病[4]。有研究顯示，紅景天苷有抑制肺組織炎癥的作用，可以抑制膿毒癥引起的肺組織損傷[5]。紅景天苷還可以降低急性肺損傷炎性因子水平[6]。紅景天苷治療以后的低氧性肺動脈高壓大鼠肺組織損傷程度降低，肺組織中炎性因子水平下降[7]。紅景天苷在重癥肺炎中的作用目前還不明確。重癥肺炎的發(fā)生與多個信號通路有關(guān)，這些信號通路共同影響疾病的進程。NF-κB(活化B細(xì)胞κ輕鏈增強子的核因子)和p38是目前發(fā)現(xiàn)的在重癥肺炎中過度激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其過度激活促進肺組織炎癥發(fā)展[8]。既往的實驗表明，紅景天苷能夠降低p38磷酸化水平抑制神經(jīng)損傷[9]。紅景天苷改善哮喘肺組織炎癥與下調(diào)NF-κB信號通路激活水平有關(guān)[10]。本實驗以肺炎克雷伯菌誘導(dǎo)構(gòu)建重癥肺炎大鼠模型，研究紅景天苷對重癥肺炎大鼠肺組織炎癥的影響及可能機制，為紅景天苷治療重癥肺炎的應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 動物、主要藥物、試劑和儀器

SPF雄性SD大鼠45只，體重180—220g，動物許可證號為SCXK(滬)2012-0002；紅景天苷購自成都瑞芬思生物科技有限公司；肺炎克雷伯菌購自美國ATCC；白細(xì)胞介素-10(IL-10)含量檢測試劑盒購自北京熱景生物技術(shù)有限公司；白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)含量檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；白細(xì)胞介素-6(IL-6)含量檢測試劑盒購自美國Abnova；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量檢測試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司；一氧化氮(NO)含量檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；p-p38抗體、p65抗體、iNOS抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology；p38抗體購自美國Cell Signaling Technology。

1.2 重癥肺炎大鼠模型構(gòu)建

重癥肺炎大鼠模型構(gòu)建方法根據(jù)文獻[1]進行，步驟為：大鼠造模前12h禁食，不限制飲水。按照3ml/kg的劑量腹腔注射10%的水合氯醛將大鼠麻醉，固定至手術(shù)臺上，頸部皮膚消毒后，無菌剪開頸部皮膚組織，將皮下組織分離，使上段的氣管暴露，吸取250μl肺炎克雷伯菌液(1.2×109CFU/ml)注射至氣管內(nèi)，然后立即將大鼠豎立20s，促進菌液在左右兩側(cè)的肺組織中均勻分布。小心將傷口縫合，消毒以后，監(jiān)測大鼠的精神狀態(tài)。接種6天后，造模大鼠均出現(xiàn)呼吸急促、嗜睡、進食減少、反應(yīng)差，造模成功。

1.3 大鼠分組及各組處理

取造模成功大鼠36只，隨機分為模型組、紅景天苷小劑量組、紅景天苷大劑量組、地塞米松組，同時設(shè)置對照組(手術(shù)過程中用生理鹽水代替肺炎克雷伯菌)，每組9只。紅景天苷小劑量和大劑量組分別腹腔注射20mg/kg、40mg/kg的紅景天苷[11]；地塞米松組大鼠腹腔注射0.8mg/kg的地塞米松[12]；對照組和模型組注射等劑量的生理鹽水。各組大鼠每天注射1次，連續(xù)注射6天。

1.4 大鼠動脈血和肺泡灌洗液采集

藥物治療6天后，采集各組大鼠腹主動脈血各2ml，用于血氣指標(biāo)：動脈血氧分壓(PaO2)、血氧飽和度(SaO2)、動脈血二氧化碳分壓(PaCO2)的檢測。采集肺泡灌洗液，在大鼠的左肺中注射2ml的生理鹽水，緩緩按摩左肺組織30s，然后將灌注的液體抽回，再次灌注抽回的液體，反復(fù)灌注3次，最后收集的灌注液體為第1次灌洗液。然后再用生理鹽水灌注肺組織，共收集3次灌洗液。將3次收集的灌洗液混合，用于檢測炎性因子(IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10和NO)水平。

1.5 肺組織干/濕比重檢測

取大鼠右前葉肺組織，首先在電子天平上稱量肺組織的濕重，然后把肺組織放在80℃的烘箱內(nèi)持續(xù)烘干20h，再次用電子天平測量肺組織的干重。計算肺組織干/濕比重。

1.6 IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10含量檢測

用ELISA法檢測肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10含量，步驟均按照酶標(biāo)儀和試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進行。

1.7 肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞計數(shù)

將肺泡灌洗液輕輕搖勻后，小心涂抹到玻片上，室溫條件下晾干，滴加瑞氏-吉姆薩染液A，在室溫內(nèi)固定2min，再吸取瑞氏-吉姆薩染液B滴加到細(xì)胞上，孵育10min，以雙蒸水反復(fù)洗滌2次，室溫晾干，計數(shù)炎性細(xì)胞數(shù)目。

1.8 肺泡灌洗液NO含量檢測

用Griess法檢測肺泡灌洗液中NO含量，操作步驟按NO檢測試劑盒要求進行。

1.9 肺組織p38、p-p38、p65、iNOS蛋白表達

用Western blot方法檢測肺組織中p38、p-p38、p65、iNOS蛋白表達，步驟為：收集右肺上葉組織，用PBS反復(fù)洗滌，直至洗滌溶液清亮。將肺組織剪碎，取0.1mg的肺組織，添加含有PMSF的RIPA裂解溶液，充分混合以后，冰上裂解，期間每隔5min吹打混合1次。30min以后，將裂解溶液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，放在4℃離心機中，以12 000g離心10min。小心吸取上清溶液，BCA法測定上清液中蛋白濃度，在蛋白樣品中加入5×Loading BUffer溶液混勻，于100℃煮沸5min。按照常規(guī)方法安裝SDS-PAGE裝置，使用10%的分離膠以及5%的濃縮膠進行電泳。本次實驗蛋白上樣量為30μg。在濃縮膠中采用90V的電壓電泳30min后，將電壓調(diào)整到120V繼續(xù)電泳2h。將NC膜裁剪，以90V的電壓進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜溫度為4℃。將NC膜取出，放在5%牛血清白蛋白溶液中孵育2h,封閉非特異性的結(jié)合位點。然后將NC膜依次放在一抗、二抗溶液中室溫孵育2h。一抗和二抗均用封閉液稀釋，一抗按照1∶1 000稀釋，二抗按照1∶2 000稀釋。用ECL方法顯色。內(nèi)參設(shè)置為GAPDH。分析條帶的灰度值，以目標(biāo)蛋白與GAPDH蛋白灰度值的比值表示該蛋白的相對表達水平。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血氣指標(biāo)比較

各組大鼠PaO2、PaCO2和SaO2水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與對照組比較，模型組大鼠PaO2、SaO2降低，PaCO2升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t均>3.961，P<0.01)。與模型組比較，紅景天苷小劑量組、紅景天苷大劑量組、地塞米松組大鼠PaO2、SaO2升高，PaCO2降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t均>2.632，P<0.05)。紅景天苷大劑量組對PaO2、SaO2升高和PaCO2降低作用優(yōu)于紅景天苷小劑量組(t均>2.286，P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血氣指標(biāo)變化

2.2 各組大鼠肺組織干/濕比重比較

各組大鼠肺組織干/濕比重差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與對照組比較，模型組大鼠肺組織干/濕比重升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.923，P<0.01)。與模型組比較，紅景天苷小劑量組、紅景天苷大劑量組、地塞米松組大鼠肺組織干/濕比重降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t均>2.774，P<0.05)。紅景天苷大劑量組對大鼠肺組織干/濕比重的降低作用優(yōu)于紅景天苷小劑量組(t=3.930，P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肺組織干/濕比重

2.3 各組大鼠肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10含量和炎性細(xì)胞數(shù)量比較

各組大鼠肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10含量和炎性細(xì)胞數(shù)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與對照組比較，模型組大鼠肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10含量和炎性細(xì)胞數(shù)量均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t均>13.288，P<0.01)。與模型組比較，紅景天苷小劑量組、紅景天苷大劑量組、地塞米松組大鼠肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10含量和炎性細(xì)胞數(shù)量均減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t均>5.309，P<0.05)。紅景天苷大劑量組對大鼠肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10含量和炎性細(xì)胞數(shù)量的減弱作用優(yōu)于紅景天苷小劑量組(t均>6.667，P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10水平和炎性細(xì)胞數(shù)量

2.4 各組大鼠肺泡灌洗液中NO含量和肺組織中iNOS蛋白表達比較

各組大鼠肺泡灌洗液中NO含量和肺組織中iNOS蛋白表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與對照組比較，模型組大鼠肺泡灌洗液中NO含量和肺組織中iNOS蛋白表達水平均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t均>14.310，P<0.01)。與模型組比較，紅景天苷小劑量組、紅景天苷大劑量組、地塞米松組大鼠肺泡灌洗液中NO含量和肺組織中iNOS蛋白表達水平均減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t均>6.910，P<0.01)。紅景天苷大劑量組對大鼠肺泡灌洗液中NO含量和肺組織中iNOS蛋白表達水平的減弱作用優(yōu)于紅景天苷小劑量組(t均>4.120，P<0.05)。見圖1和表4。

表4 各組大鼠肺泡灌洗液中NO水平和肺組織中iNOS蛋白水平

圖1 Western blot方法檢測肺組織中iNOS蛋白表達變化

2.5 各組大鼠肺組織中p38、p-p38、p65蛋白水平比較

各組大鼠肺組織中p38、p-p38、p65蛋白表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與對照組比較，模型組大鼠肺組織中p-p38/p38、p65蛋白水平均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t均>13.370，P<0.01)。與模型組比較，紅景天苷小劑量組、紅景天苷大劑量組、地塞米松組大鼠肺組織中p-p38/p38、p65蛋白水平均減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t均>3.750，P<0.05)。紅景天苷大劑量組對大鼠肺組織中p-p38/p38、p65蛋白水平的減弱作用優(yōu)于紅景天苷小劑量組(t均>4.200，P<0.05)。見圖2和表5。

表5 各組大鼠肺組織中p-p38/p38、p65蛋白水平

圖2 Western blot方法檢測肺組織中p38、p-p38、p65蛋白表達變化

3 討 論

紅景天是一種珍稀野生植物，含有很多活性成分，如黃酮類、苷類、鞣質(zhì)、香豆素類等等，具有抗炎、抗疲勞、強心、抗氧化等功效[13]。紅景天苷是從紅景紅景天全草或者根莖中分離得到的活性成分，有抗衰老、抗腫瘤、抗輻射、促進神經(jīng)修復(fù)、降血脂等作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷有抑制炎癥的功能，其可以減弱內(nèi)毒素誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)，抑制乳腺炎小鼠模型中炎癥因子如TNF-α、IL-1β的表達[14,15]。紅景天苷對肺組織炎癥也有改善作用[7]。哮喘小鼠經(jīng)過紅景天苷處理以后，肺組織損傷程度明顯改善，肺組織中炎性因子水平降低[10]。后續(xù)在百草枯、內(nèi)毒素引起的急性肺損傷中同樣發(fā)現(xiàn)了紅景天苷的抗炎和肺組織保護作用[16,17]。本實驗發(fā)現(xiàn)，紅景天苷治療以后的重癥肺炎大鼠血氣指標(biāo)PaO2、SaO2、PaCO2明顯改善，肺組織干/濕比重也明顯降低，肺泡灌洗液中炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10水平下降，炎性細(xì)胞數(shù)目減少，提示紅景天苷有改善重癥肺炎大鼠炎癥損傷的作用。

炎癥反應(yīng)發(fā)生過程中，除了有炎性因子、炎性細(xì)胞的參與以外，炎性介質(zhì)如NO也發(fā)揮了極為重要的作用[18]。研究報道顯示，NO在生命體內(nèi)的作用具有雙面性，一方面，適量的NO可以調(diào)控血液流動速度，抑制血小板的黏附，調(diào)控機體免疫反應(yīng)，另一方面，NO過量產(chǎn)生可以誘導(dǎo)多種疾病的發(fā)生，其中以炎癥性疾病最為常見，例如關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎、感染性休克等[19]。NO被認(rèn)為是一種炎癥介質(zhì)，具有促進炎癥反應(yīng)的作用[20]。機體內(nèi)的NO是由NOS合成的，NOS有3種，其中iNOS是一種非Ca2+依賴性的蛋白酶，其可以被病原微生物激活，促進下游信號通路如NF-κB的活化，iNOS在疾病進展中發(fā)揮主要作用[21]。本次的實驗結(jié)果顯示，重癥肺炎大鼠肺泡灌洗液中NO的含量升高，iNOS蛋白表達水平也升高，而紅景天苷治療后的大鼠NO和iNOS的水平均下降，提示紅景天苷可以降低NO釋放水平，進而抑制炎癥反應(yīng)。

信號通路在生命體中的作用廣泛，不僅參與正常的生理進程，還與疾病發(fā)生有關(guān)[22]。重癥肺炎的發(fā)生是一個極為復(fù)雜的過程，其發(fā)生與多個信號通路如NF-κB、p38等密切相關(guān)[8]。有研究表明，肺組織炎癥發(fā)生過程中NF-κB、p38過度激活，而下調(diào)其激活程度能夠改善肺組織炎癥損傷程度[23，24]。NF-κB信號通路的組成復(fù)雜，其包含多個亞單位，p65是NF-κB信號的關(guān)鍵亞單位，p65表達改變與NF-κB信號激活程度呈正比[25]。p38是MAPK信號通路的重要分支，其只有被磷酸化后形成p-p38才能夠激活p38信號通路，發(fā)揮生物學(xué)作用[26]。既往的實驗發(fā)現(xiàn)，紅景天苷的作用機制與NF-κB、p38有關(guān)，其可以下調(diào)這兩個信號通路的激活水平進而發(fā)揮抗炎作用。本次實驗結(jié)果顯示，紅景天苷治療以后的重癥肺炎大鼠模型肺組織中p65、p-p38水平降低，提示紅景天苷降低肺組織中NF-κB、p38通路活化水平，說明紅景天苷抗重癥肺炎肺組織炎癥作用機制可能與NF-κB、p38通路有關(guān)。

綜上，紅景天苷可能是治療重癥肺炎的有效藥物，能夠改善重癥肺炎大鼠血氣指標(biāo)，減少肺組織炎癥介質(zhì)的釋放和炎性細(xì)胞數(shù)目，抑制NF-κB、p38通路激活，為紅景天苷治療重癥肺炎的臨床應(yīng)用提供了理論數(shù)據(jù)?，F(xiàn)階段尚不明確紅景天苷通過何種機制影響NF-κB、p38進而調(diào)控炎癥進展，在以后的實驗中會進行驗證和補充探討。

?