封寶紅 伍 軍 李相友 喻業(yè)安 張艷霞 朱戈麗 黃 徽

隨著我國(guó)居民生活水平的提高和生活方式的改變，高尿酸血癥(HUA)患病率逐年上升，發(fā)展為我國(guó)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[1]，HUA成為腎臟病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。尿酸性腎病是由于尿酸作用于腎臟，引起腎臟的損傷，且該病發(fā)病率日益升高的趨勢(shì)得到廣泛關(guān)注，但目前尚未有療效確切的治療藥物，尋找療效確切的藥物，成為提高尿酸性腎病治愈率的重要研究方向。近年來(lái)，已有研究表明傳統(tǒng)中藥槲皮素在HUA的治療中發(fā)揮著重要作用[2]。槲皮素是廣泛存在于日常飲食中一種植源性黃酮類(lèi)化合物，研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過(guò)線粒體信號(hào)通路發(fā)揮抗炎、抗氧化等生物學(xué)作用，改善尿酸性腎病的腎功能[3]。也有研究表明，槲皮素在體外實(shí)驗(yàn)可有效抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲，其分子機(jī)制是通過(guò)細(xì)胞周期阻滯和線粒體介導(dǎo)的凋亡實(shí)現(xiàn)的[4]。磷脂酰肌醇激酶(PI3K)/蛋白激酶B (AKT)信號(hào)通路參與細(xì)胞的增殖、分化[4]，在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[5]。目前尚無(wú) PI3K/AKT信號(hào)通路在槲皮素對(duì)尿酸性腎病細(xì)胞生物學(xué)行為中作用的研究。因此，本研究探討了槲皮素對(duì)尿酸刺激下腎小管上皮細(xì)胞增殖、線粒體功能的影響，旨在為尿酸性腎病的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

大鼠腎小管上皮細(xì)胞 NRK-52E株(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，貨號(hào)GNR8)。

1.2 主要試劑

尿酸(美國(guó) Sigma公司，貨號(hào)U2625)，槲皮素(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)Q4951)，DMEM 培養(yǎng)基(GIBCO，貨號(hào)2268522)，胎牛血清(GIBCO，貨號(hào)2132094P)，JC-1(江蘇碧云天生物科技公司，貨號(hào)050920200908)，ROS(江蘇碧云天生物科技公司，貨號(hào)s0033)，鼠單抗PI3K(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)10002078)，兔多抗雷帕霉素靶蛋白(mTOR，貨號(hào)AF6308)、兔多抗AKT(Affinity，貨號(hào)AF6061)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理:將NRK-52E細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、CO2孵箱中培養(yǎng)，細(xì)胞的密度達(dá)到80%時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代。以1∶2-1∶4 的比例接種于新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。隨后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分成3組：空白對(duì)照組(N組)：培養(yǎng)基中不加入任何物質(zhì)；尿酸干預(yù)組(U組)：培養(yǎng)基中加入0.4mmol/L 尿酸；槲皮素干預(yù)組(Q組)：培養(yǎng)基中加入15mg/L槲皮素孵育24h再加入0.4mmol/L 尿酸。

1.3.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖率:取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)狀態(tài)良好的NRK-52E細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/ml，接種到96孔板，每孔100μl細(xì)胞懸液， 37℃培養(yǎng)過(guò)夜(在細(xì)胞孔周?chē)變?nèi)加入100μl無(wú)菌PBS)；按1.3.1中方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組處理，每組6個(gè)復(fù)孔，37℃培養(yǎng)24h。每孔加入10μl MTT，37℃培養(yǎng)4h，吸出培養(yǎng)基，加入150μl DMSO震蕩10min，于568nm測(cè)定各孔吸光度值(OD)。

1.3.3 JC-1檢測(cè)線粒體膜電位: 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)接種于細(xì)胞培養(yǎng)6孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜；按1.3.1中方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組處理，37℃培養(yǎng)24h。取適量Vortex加入2ml JC-1染色緩沖液和一定比例的超純水，混勻后即為JC-1染色工作液。將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液吸除，然后加入0.1ml細(xì)胞培養(yǎng)液和0.1ml JC-1染色工作液，并充分混合。放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20min后棄上清，然后用JC-1染色緩沖液 (1×)洗滌兩次。于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，通過(guò)綠、紅熒光強(qiáng)度的比值來(lái)判斷細(xì)胞線粒體膜電位的變化。Image J圖像軟件分析綠色熒光與紅色熒光平均熒光值并計(jì)算其比值，比值越大，表示線粒體膜電位下降越明顯。

1.3.4 活性氧(ROS)的檢測(cè): 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)接種于細(xì)胞培養(yǎng)6孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，按1.3.1中方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組處理，37℃培養(yǎng)24h后用0.25%胰酶消化細(xì)胞，終止消化后收集細(xì)胞，1 500rpm離心5min，去上清，加PBS重懸。PBS將細(xì)胞潤(rùn)洗2次，1 500rpm離心5min，去PBS加入稀釋好的DCFH 1ml，按照1∶1 000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10μmol/L，37℃培養(yǎng)箱孵育20min，每隔3min混勻一次，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，1 500rpm離心5min，去上清，加PBS重懸，采用熒光顯微鏡觀察DCF的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定性檢測(cè)，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)熒光強(qiáng)度值。

1.3.5 Western blot 檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)情況：分組處理后的細(xì)胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，吸除培養(yǎng)上清，加入RIPA裂解液 (含PMSF) 提取總蛋白, BCA法測(cè)蛋白濃度，取等質(zhì)量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離, 電泳結(jié)束后將蛋白半干轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用含5% 脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF膜，室溫?fù)u床封閉2h。磷酸化蛋白用1%-3%的BSA封閉。加入一抗4℃孵育過(guò)夜(PI3K 1∶3 000，AKT 1∶1 000，p-AKT 1∶2 000，mTOR 1∶500)，于二抗1∶50 000孵育液中，37℃搖床孵育2h。洗脫后用超敏ECL發(fā)光液顯色，X光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影，沖洗膠片，掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值。結(jié)果以目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值的比值來(lái)進(jìn)行定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 腎小管上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

于倒置光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，N組NRK- 52E 細(xì)胞呈典型的鵝卵石或鋪路石樣形態(tài)，U組細(xì)胞體積變小，皺縮，變形，折光性減弱，變得灰暗，懸浮細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增加，細(xì)胞之間接觸減少。Q組細(xì)胞呈扁平多角形狀，折光性增強(qiáng)，生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞間隔減小，細(xì)胞之間接觸緊密(圖1)。

圖1 各組細(xì)胞形態(tài)(光學(xué)顯微鏡，×10)

2.2 NRK-52E細(xì)胞增殖情況

各組細(xì)胞增殖差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與N組比較，U組細(xì)胞增殖率明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=24.65，P<0.01)。與U組比較，Q組細(xì)胞增殖率升高，差異有統(tǒng)計(jì)意義(t=3.24，P<0.05)。

表1 各組細(xì)胞增殖率均=6)

2.3 線粒體功能的變化指標(biāo)

2.3.1 線粒體膜電位的變化：U組細(xì)胞于熒光顯微鏡下觀察可以看到紅色熒光向綠色熒光轉(zhuǎn)變?cè)龆啵琎組于熒光顯微鏡下觀察可以看到紅色熒光向綠色熒光轉(zhuǎn)變減少。各組線粒體膜電位水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與N組相比,U組線粒體膜電位下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.65，P<0.01),Q組較U組膜電位上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.99，P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞JC-1 529/590nm綠色熒光與紅色

2.3.2 ROS生成情況：于熒光顯微鏡下定性觀察ROS的生成情況，結(jié)果顯示，U組較N組ROS的生成明顯增多，Q組較U組ROS生成減少。

圖2 各組細(xì)胞線粒體JC-1紅色和綠色熒光(熒光顯微鏡,×40)

流式細(xì)胞儀分析活性氧的熒光程度結(jié)果顯示，各組細(xì)胞ROS生成差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。U組ROS熒光強(qiáng)度較N組明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=29.74，P<0.01)，Q組ROS的生成較U組減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.20，P<0.05)。見(jiàn)圖3、圖4和表3。

表3 各組細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度均=6)

圖3 各組細(xì)胞ROS生成情況(熒光顯微鏡,×40)

圖4 NRK-52E細(xì)胞活性氧熒光強(qiáng)度的變化(流式細(xì)胞儀)

2.4 槲皮素對(duì)PI3K、AKT、pAKT、mTOR蛋白表達(dá)的影響

各組PI3K、AKT、pAKT、mTOR蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。U組PI3K、pAkt、AKT、mTOR蛋白表達(dá)水平顯著低于N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t均>7.73，P<0.01)；Q組PI3K、pAkt、AKT、mTOR蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t均>3.43，P<0.01)。見(jiàn)圖5、表4。

表4 各組細(xì)胞相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較均=6)

圖5 各組細(xì)胞PI3K、AKT、pAKT、mTOR蛋白表達(dá)(Western blot)

3 討 論

本課題組以往實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，尿酸致體外腎小管上皮細(xì)胞損傷表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡，該作用與尿酸破壞線粒體形態(tài)、結(jié)構(gòu)，上調(diào)細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中Pgam5/Drp1表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡線有關(guān)[6]。槲皮素是黃酮類(lèi)化合物，研究表明槲皮素在體內(nèi)外模型中可以通過(guò)清除 ROS 而抑制炎癥小體活化[7]，能通過(guò)線粒體去極化，引起 Bcl2/Bax比值失衡，下調(diào)IL-6/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子3(IL-6/STAT3)信號(hào)通路，誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系細(xì)胞凋亡[8]。更有研究表明，槲皮素可明顯緩解高果糖飲食或氧嗪酸鉀鹽誘導(dǎo)的高尿酸血癥，并減輕腎損傷[9,10]。

本研究發(fā)現(xiàn)尿酸能夠引起NRK-52E細(xì)胞的形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，細(xì)胞的增殖率下降，線粒體膜電位明顯下降，活性氧的生成增多，而槲皮素干預(yù)組中，細(xì)胞形態(tài)有所改善，細(xì)胞增值率升高，線粒體膜電位有所上升，活性氧生成減少。本結(jié)果提示，尿酸可導(dǎo)致腎小管上皮線粒體功能障礙，而槲皮素可以穩(wěn)定線粒體功能。

PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路激活，與細(xì)胞的增殖、存活、遷移、凋亡及血管發(fā)生轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[11]。PI3K作為IGFR下游的主要的主要信號(hào)原件之一，通過(guò)活化PIP3，激活其下游信號(hào)分子Akt，提高Akt磷酸化表達(dá)水平，進(jìn)而調(diào)控相關(guān)靶蛋白發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、存活及遷移等[12]。本文研究結(jié)果顯示槲皮素組PI3K/Akt信號(hào)通路的相關(guān)分子(PI3K、AKT、pAKT、mTOR)的表達(dá)增加，線粒體膜電位較尿酸干預(yù)組恢復(fù)，減少了活性氧的生成，細(xì)胞增殖率升高。這些結(jié)果表明槲皮素的細(xì)胞保護(hù)作用與保護(hù)線粒體功能密切相關(guān)，可以導(dǎo)致自由基產(chǎn)生減少，減少氧化損傷及細(xì)胞凋亡。

綜上所述，尿酸是誘導(dǎo)腎小管損傷的一個(gè)重要的危險(xiǎn)因素，而槲皮素可以對(duì)尿酸致細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用，其機(jī)制與激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路有關(guān)，下調(diào)ROS的生成、穩(wěn)定線粒體膜電位，從而減少細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，為尿酸性腎損傷的治療提供了新的治療策略和理論依據(jù)。

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