徐艷梅，程新杰，卞廣利，閆凱，高燕霞

（1.河北省藥品醫(yī)療器械檢驗研究院，石家莊 050011； 2.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院藥學部，石家莊 050000）

基因毒性雜質(zhì)又稱遺傳毒性雜質(zhì)，在痕量下即可損傷人類的DNA，具有一定的致癌性和致突變性，嚴重威脅人類的健康［1–2］。N-亞硝基二甲胺（NDMA）是一種常見的N-亞硝胺類化合物，多來源于消毒劑、添加劑等生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物，普遍存在于水［7］、食品［8–9］、煙草［10–11］中，NDMA毒性強，具有致癌、致畸和致突變作用［12–13］。自從纈沙坦中檢測出N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)后，為保證藥品的質(zhì)量和安全性，N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)的檢測便備受國內(nèi)外藥監(jiān)部門的關注。近年來，企業(yè)對藥品中基因毒性雜質(zhì)的控制越來越嚴格，檢測藥品中N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)的研究方法逐漸增多［3–6］，如高效液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法等。

二甲雙胍格列本脲片（Ⅰ）是口服的復方降糖藥，其療效好、用量少、副作用低，主治經(jīng)飲食控制、運動和服用二甲雙胍或者磺脲類藥物仍未不能控制血糖的Ⅱ型糖尿?。?4］。目前，僅見鹽酸二甲雙胍緩釋片中N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)檢測的報道［15–16］，而二甲雙胍格列本脲片（Ⅰ）中NDMA的檢測至今尚未見報道。為確保藥品質(zhì)量及其應用的安全，應嚴格控制藥品中的基因毒性雜質(zhì)。筆者建立了檢測二甲雙胍格列本脲片（Ⅰ）中基因毒性雜質(zhì)NDMA的高效液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用法，為藥品的質(zhì)量控制提供參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)：LC–30AD型高效液相色譜儀，日本島津公司。

質(zhì)譜儀：Triple Quad 6500型，美國AB SCIEX公司。

電子天平：XS105型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒–托利多公司。

N-亞硝基二甲胺對照品：含量為99.9%，批號為1681903，美國TMstandard公司。

二甲雙胍格列本脲片（Ⅰ）：批號分別為2011030304、2011040304、2011020304，市售。

甲醇、甲酸：色譜純，賽默飛世爾科技中國有限公司。

實驗用水為超純水。

1.2 溶液的配制

N-亞硝基二甲胺對照品儲備溶液：精密稱定N-亞硝基二甲胺對照品25 mg，置于25 mL容量瓶中，加適量甲醇溶液使其溶解，并稀釋至標線，搖勻，制成質(zhì)量濃度為1 mg／mL的對照品儲備溶液。分析前用甲醇稀釋成所需濃度。

樣品溶液：取二甲雙胍格列本脲片（Ⅰ）20片，研細，精密稱取細粉500 mg，置于10 mL容量瓶中，加入適量甲醇溶液振搖使其溶解，用水定容至標線，搖勻，即得。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜條件

色 譜 柱：ACE C18–HL色 譜 柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，廣州菲羅門科學儀器有限公司）；柱溫：40 ℃；流動相：A相為0.1%甲酸–水溶液，B相為甲醇；梯度洗脫：洗脫程序列于表1，流量為0.6 mL／min；進樣體積：5 μL。

表1 梯度洗脫程序

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：大氣壓化學電離源（APCI源）；檢測模式：正離子模式檢測；掃描模式：多反應監(jiān)測模式（MRM）；離子源溫度（TEM）：350 ℃；脫溶劑氣流量：35 mL／min；NC電流：3 μA；氣簾氣（CUR）：206.8 kPa；霧化氣（GS1）壓力：241.3 kPa。

2 結果與討論

2.1 溶劑的選擇

二甲雙胍格列本脲片（Ⅰ）中含有輔料羥丙甲纖維素，其溶于水及大多數(shù)極性溶劑，然而羥丙甲纖維素在水中會溶脹成澄清或微濁膠體溶液，嚴重影響鹽酸二甲雙胍的溶解性，故應避免使用水作為溶劑。試驗考察了甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基亞砜、四氫呋喃、三氯甲烷和甲苯的溶解性和適用性，最終選擇甲醇作為溶劑。

2.2 耐用性考察

改變流量、柱溫、流動相B的初始比例考察建立方法的耐用性［17–18］。結果表明，微調(diào)流速、柱溫、流動相B的初始比例后，基因毒性雜質(zhì)N-亞硝基二甲胺的測定值基本一致，說明該方法中的色譜條件耐用性良好。

2.3 系統(tǒng)適應性試驗

取N-亞硝基二甲胺對照品溶液、樣品溶液和溶劑，按1.3.1色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，樣品溶液色譜圖見圖1，N-亞硝基二甲胺加標色譜圖見圖2。由圖1.圖2可知，在該色譜條件下，N-亞硝基二甲胺色譜峰形較好，且溶劑不干擾測定，說明該方法的專屬性較好。

圖1 樣品溶液色譜圖

圖2 N-亞硝基二甲胺加標色譜圖

2.4 線性關系、檢出限與定量限

精密量取1.2對照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、5、10 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至標線，制成質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、50、100 ng／mL的標準工作液。將上述溶液分別注入液相色譜–質(zhì)譜儀，按1.3.1色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，以N-亞硝基二甲胺對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），以色譜峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸分析，計算得到線性回歸方程Y=75 391X+44 066，相關系數(shù)r=0.999 8，N-亞硝基二甲胺的質(zhì)量濃度在1.026 8～102.68 ng／mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關系良好。

取1.2對照品溶液逐步稀釋成不同濃度，按1.3色譜條件進樣分析，連續(xù)測定6次，記錄色譜圖，以信噪比S／N=3和S／N=10分別確定檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。結果表明，N-亞硝基二甲胺的檢出限和定量限分別為0.034 2 ng／mL和0.102 68 ng／mL。

2.5 加標回收試驗

精密稱取樣品約100 mg，共9份，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解，再分別精密加入N-亞硝基二甲胺對照品溶液0.2、0.5、1.0 mL各3份，加溶劑定容至標線，搖勻。按1.3色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，計算加標回收率，結果列于表2。由表2可知，N-亞硝基二甲胺的平均回收率為96.32%，測定結果的相對標準偏差為8.5%，表明本法的回收率良好。

表2 加標回收試驗結果（n=3）

2.6 穩(wěn)定性試驗

按1.2制備N-亞硝基二甲胺對照品溶液。稱取樣品溶液約100 mg，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解，再精密加入N-亞硝基二甲胺對照品溶液0.2 mL，加甲醇定容至標線，搖勻，制備成N-亞硝基二甲胺加標溶液。取室溫下放置0、1、2、3、6、10 h后的對照品溶液和加標樣品溶液，按1.3色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，以N-亞硝基二甲胺的色譜峰面積考察溶液穩(wěn)定性，結果列于表3。

由表3可知，N-亞硝基二甲胺對照品溶液色譜峰面積的相對標準偏差為0.3%，而加標樣品溶液中色譜峰面積的相對標準偏差為0.7%，表明上述兩種溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3 對照品與樣品溶液穩(wěn)定性試驗結果

2.7 樣品測定

取適量二甲雙胍格列本脲片（Ⅰ）（批號分別為2011030304，2011040304，2011020304），按1.2配制樣品溶液，按1.3色譜條件分析，采用標準曲線法計算含量。結果表明，3批二甲雙胍格列本脲片（Ⅰ）中均未檢測出基因毒性雜質(zhì)N-亞硝基二甲胺。

3 結語

建立了高效液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用法檢測二甲雙胍格列本脲片（Ⅰ）中的基因毒性雜質(zhì)N-亞硝基二甲胺，該方法操作簡便、靈敏、準確、重復性好?？捎糜诒O(jiān)控二甲雙胍格列本脲片（Ⅰ）中基因毒性雜質(zhì)的水平，不僅為其質(zhì)量控制提供參考，還能夠確保藥品的安全性，具有實際應用價值。