米 智，劉荔貞，武曉紅，李旭東

（1.山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西大同 037009；2.山西大同大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山西大同 037009）

啤酒是以大麥芽或添加輔料，啤酒花和水為主要原料，經(jīng)過酵母菌發(fā)酵釀制而成的，含有大量CO2、酒精。原漿啤酒是不加水，不經(jīng)過濾，不經(jīng)滅活工序，保留鮮活酵母的生啤酒原液。啤酒具有良好的口感，素有液體面包美稱而頗受消費大眾的喜愛[1]。

啤酒風(fēng)味主要有：聞到的香氣（aroma）、嘗到的口味（taste）和感覺到的口感（mouthfeel）[2]。消費者選擇啤酒的主要依據(jù)是酒味、口感和性價比，口感成了消費者關(guān)注的重要質(zhì)量參數(shù)之一[3]?；瘜W(xué)成分決定了啤酒的質(zhì)量品質(zhì)和風(fēng)味特色[3]。高級醇類和酯類物質(zhì)對啤酒特有的風(fēng)味和香氣有著至關(guān)重要的作用[4]，如乙酸乙酯、異戊酯乙酸乙酯、己酸乙酯和辛酸乙酯負(fù)責(zé)為“水果味”味道[5]。它們之間巧妙的平衡協(xié)調(diào)關(guān)系，便形成了啤酒獨特的風(fēng)格。啤酒的苦澀味主要來源于酒花中的樹脂，還有部分來自酵母釀造過程的苦味肽、氨基酸、多酚等非酒花成分的共同作用[6-7]。也有文獻(xiàn)報道稱，啤酒的風(fēng)味和香氣與二氧化碳壓力具有相關(guān)性[8-9]。啤酒中所有風(fēng)味活性成分都是由酵母菌生命代謝活動產(chǎn)生的，這些化合物決定啤酒的最終質(zhì)量[10]。

適量飲用啤酒，可降低冠心病等心臟病的發(fā)病率，降低糖尿病的死亡率等[11-12]。啤酒還具有抗菌作用和預(yù)防骨質(zhì)疏松和動脈硬化，調(diào)節(jié)腸道生態(tài)平衡，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，控制血清中的膽固醇等功能[13]。

本研究跟蹤山西大同大學(xué)生物工程試驗中心啤酒釀造和發(fā)酵整個過程，利用生物化學(xué)檢測從麥芽醪進(jìn)罐第1 d 到成品原漿啤酒出酒期間蛋白質(zhì)和總糖含量變化情況，期望找到二者含量隨時間變化的規(guī)律；成品酒出酒后，與市場常見品牌啤酒進(jìn)行比較，以期為該試驗中心釀酒工藝改良提供參考及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉，重慶地茂化工試劑有限公司；結(jié)晶酚，西安天茂化工有限公司；亞硫酸鈉，濟(jì)寧宏明化學(xué)試劑有限公司；碘、碘化鉀、葡萄糖，天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司；酚酞，無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；磷酸，北京世紀(jì)拓鑫精細(xì)化工有限公司；95%乙醇、氫氧化鈉、考馬斯亮藍(lán)、牛血清白蛋白，上海源葉生物科技有限公司。以上試劑均為分析純。原漿成品啤酒由山西大同大學(xué)生物工程試驗中心提供，市售常見品牌啤酒：易拉罐裝雪花、哈爾濱和純生啤酒，均為每聽330 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

山西大同大學(xué)生物工程試驗中心100 L 小試原漿啤酒生產(chǎn)線、糖度儀，山東濟(jì)南豪魯機(jī)械設(shè)備有限公司；BS600H 精密電子天平，太原世成衡器有限公司；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州市金壇友聯(lián)儀器研究所；722N可見分光光度計，大尼科（上海）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 自釀原漿啤酒生產(chǎn)工藝

參考米智等[1]原漿酒生產(chǎn)過程及工藝流程。

1.3.2 總糖含量的測定

（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

相關(guān)報道稱，3,5-二硝基水楊酸分光光度法用于測定食品中總糖含量基本可行且準(zhǔn)確性較高[14-15]。本文測定總糖采用武平[16]和張龍翔[17]的方法，以葡萄糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線性回歸方程。

取干燥潔凈的試管8支，編號0～7，按順序分別加1 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，加蒸餾水補(bǔ)充至2 mL，再分別加DNS 試劑1.5 mL，沸水浴5 min，冷卻至室溫，加21 mL蒸餾水混合均勻后，以0 號管為對照，在540 nm 下測定各管吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）啤酒總糖的測定

原漿啤酒發(fā)酵過程大約需要14 d 時間，故該實驗總糖檢測從麥芽醪進(jìn)發(fā)酵罐第1 d 開始，到成品酒出酒為止，每天同一時間同一發(fā)酵罐取樣，盡可能做到實驗間隔24 h，做平行實驗3 次?？偺菧y定方法同葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，數(shù)據(jù)處理公式：

總糖濃度=m×V-1×n×0.9/1000

式中：m為反應(yīng)液中總糖的質(zhì)量（mg）；V為反應(yīng)液的體積（mL）；n為稀釋倍數(shù)；0.9為糖苷鍵在斷裂時需要加一分子水；1 000 是mg 與g 之間的轉(zhuǎn)化倍數(shù)；總糖含量的最后單位為g/mL。

1.3.3 蛋白質(zhì)含量的測定

參照Bradford 改良方法[18]，以牛血清白蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。啤酒樣本預(yù)處理方法見文獻(xiàn)[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 總糖含量

2.1.1 原漿啤酒發(fā)酵過程中總糖含量

根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線所得方程為：y＝0.1848x-0.0123（x為葡萄糖濃度，y為該葡萄糖濃度下的吸光值），R2=0.9916，計算麥芽醪中總糖濃度（mg/mL）。

圖1是麥芽醪進(jìn)入發(fā)酵罐連續(xù)發(fā)酵14 d總糖含量的變化趨勢，第1 d的總糖量最高，約為94.2 mg/mL。第2～4 d總糖含量成下降趨勢，而且明顯糖含量低于第1 d，約在42.8～54.2 mg/mL 之間。在之后的10 d 內(nèi)，總糖含量約在6.7 mg/mL 上下波動，大致呈先升高后降低，再升高最后降低的變化態(tài)勢?？傮w上，總糖在麥芽醪發(fā)酵過程中顯著降低，在出酒時的總糖含量約為2.7 mg/mL。

圖1 麥芽醪連續(xù)發(fā)酵14d總糖含量變化

2.1.2 原漿成品啤酒與市售啤酒總糖含量比較

比較自釀原漿成品啤酒與3種常見市售啤酒的總糖含量，發(fā)現(xiàn)原漿成品啤酒總糖含量最高約為11.9 mg/mL，燕京啤酒含量最低約為8.4 mg/mL，而哈爾濱啤酒和純生啤酒居于二者中間，分別為9.4 mg/mL和10.5 mg/mL。

啤酒麥芽醪當(dāng)中，以糖類物質(zhì)為主，約占90%，其中可發(fā)酵性單糖占總糖類物質(zhì)的10%左右，二糖中蔗糖約占5%，麥芽糖約占45%～50%，麥芽三糖、棉子糖等三糖物質(zhì)約占10%～15%，DP4-8 的寡糖約占20%～25%，還有少量的戊糖和戊聚糖等五碳糖、β-葡萄糖、異麥芽糖，約占3%～5%[20]。能被酵母菌發(fā)酵的糖類稱為“可發(fā)酵糖”。麥芽四糖以上的寡糖、戊糖、異麥芽糖等均不能發(fā)酵，故它們會一直存在于啤酒當(dāng)中，成為啤酒浸出物的主體[21]。此外，麥芽汁當(dāng)中各種糖的濃度也會影響酵母菌的發(fā)酵，存在著“葡萄糖阻遏效應(yīng)[22-23]”、“巴士德效應(yīng)[21]”和“克拉勃脫效應(yīng)[21]”等，影響糖的分解代謝，故自釀原漿啤酒的總糖含量高于其他市售啤酒。

2.2 蛋白質(zhì)含量

2.2.1 自釀啤酒發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)含量

根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得方程為：y=0.8376x+0.0417（x為蛋白質(zhì)濃度，y為該濃度下的吸光值），R2=0.9901，計算麥芽醪中蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）。

圖2 是麥芽醪進(jìn)入發(fā)酵罐連續(xù)發(fā)酵14 d 蛋白質(zhì)含量的變化趨勢。從第1 d到第3 d，蛋白質(zhì)含量呈下降趨勢。第4 d 到第7 d，蛋白含量又呈現(xiàn)上升趨勢，蛋白質(zhì)含量略高于前3 d。在隨后的1 周時間內(nèi)，蛋白質(zhì)含量變化出現(xiàn)2 個極大值，分別是第9 d（約為2.0 mg/mL，同時也是發(fā)酵期間的最大值）和第13 d。縱觀整個發(fā)酵期間，蛋白質(zhì)含量的最低值為發(fā)酵第3 d，約為1.1 mg/mL。

圖2 麥芽醪連續(xù)發(fā)酵14 d蛋白質(zhì)含量變化

2.2.2 原漿成品啤酒與市售啤酒蛋白質(zhì)含量比較

通過測定不同品種啤酒及自釀原漿成品啤酒蛋白質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)自釀啤酒蛋白質(zhì)含量最高約為1.4 mg/mL，燕京啤酒含量最低約為0.6 mg/mL，而哈爾濱啤酒和純生啤酒居于二者中間，分別為0.8 mg/mL和0.7 mg/mL。啤酒蛋白質(zhì)在很大程度上影響起泡性能[24]。蛋白質(zhì)被分解后產(chǎn)物中有氨基酸和多肽，而多肽物質(zhì)或蛋白質(zhì)的存在是形成懸浮物或（和）沉淀物的前驅(qū)物質(zhì)。因此蛋白質(zhì)含量的多少將直接影響到啤酒非生物穩(wěn)定性，進(jìn)而影響啤酒的質(zhì)量[25]。

3 結(jié)論與討論

從整個發(fā)酵過程來看，總糖含量呈下降趨勢，尤其前4d最為明顯。后10d總糖含量呈現(xiàn)波動態(tài)勢，可能與麥芽醪中糖的種類有關(guān)。

自釀原漿啤酒的總糖含量明顯高于其他3種，原因可能有：①自釀原漿啤酒沒有經(jīng)過過濾，成品酒會含有多種酵母菌不能發(fā)酵的糖類；②在釀酒過程中沒有添加任何酶制劑去水解相關(guān)的糖類，僅僅靠發(fā)芽的大麥自身水解酶系去完成各種糖類的分解，可能不是很徹底。

啤酒發(fā)酵初期，接種后的釀酒酵母只能通過吸收麥芽醪中的含氮物質(zhì)，自身繁殖擴(kuò)增，因此發(fā)酵初期麥芽汁中的蛋白質(zhì)含量會降低，隨后呈現(xiàn)波動趨勢。酵母菌的生命活動代謝均是以麥芽醪中的各種營養(yǎng)物質(zhì)為基礎(chǔ)，涉及糖、蛋白質(zhì)和脂類三大代謝通路，還有很多種風(fēng)味化學(xué)物質(zhì)，也是一些氨基酸或含氮化合物通過酵母菌轉(zhuǎn)化而來。因此，糖和蛋白質(zhì)含量在整個發(fā)酵過程含量變化與酵母菌的種類、代謝活動、發(fā)酵條件等緊密相關(guān)。