鄧宇，烏仁圖雅，李寶棟，李雯雯，榮迪，娜日娜，陳琪，趙劍平，正月，倪林俊，王巖

（1.赤峰市農(nóng)牧科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古赤峰 024000； 2.赤峰市動物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古赤峰 024000）

四環(huán)素類藥物是最常見的獸用抗生素之一。隨著畜牧業(yè)集約化、規(guī)?；B(yǎng)殖模式的發(fā)展，抗生素開始廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，不僅用于治療和預(yù)防動物傳染性疾病，還以亞治療劑量添加于畜禽飼料中用于刺激動物生長和促進增產(chǎn)［1］。因抗生素價格低廉且能產(chǎn)生較高的經(jīng)濟效益，使得畜禽養(yǎng)殖業(yè)中存在違規(guī)濫用大劑量抗生素行為。畜禽攝入的抗生素有30%～90%以原藥或代謝產(chǎn)物的形式排出體外［2］，殘留在畜禽糞便中的抗生素最終通過徑流和滲透作用進入地表水和地下水中，對環(huán)境和人體健康構(gòu)成潛在威脅［1，3］。目前，有較多文獻報道糞便、土壤、水體等環(huán)境介質(zhì)中存在較高濃度的抗生素［4–5］，其中，四環(huán)素類抗生素最為普遍［6–7］。研究表明，難降解、易吸附的四環(huán)素類抗生素可通過食物鏈傳輸，尤其是含四環(huán)素的人畜糞便作為有機肥料施用于農(nóng)田時，可能導(dǎo)致抗生素隨食物鏈積累的風(fēng)險［8］。

環(huán)境中四環(huán)素類抗生素殘留檢測的研究近年來受到了國內(nèi)外更多的重視［9–12］。因環(huán)境介質(zhì)中存在種類繁多的抗生素污染物，且存在含量較低、基體復(fù)雜等特點，建立一種準(zhǔn)確度高、快速有效的分析方法成為研究的重點。

筆者對土壤中土霉素、四環(huán)素和金霉素3種抗生素的萃取方法進行優(yōu)化，并選取最佳流動相組成和洗脫程序，以超高效液相色譜法測定，有效地降低了測定過程中土壤樣品的基質(zhì)效應(yīng)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜儀：Agilent1290型，配VWD紫外檢測器，美國安捷倫科技有限公司。

臺式冷凍離心機：Multifuge X3R型，美國賽默飛世爾科技公司。

恒溫水浴振蕩器：SHY–A型，金壇市成輝儀器廠。

固相萃取儀：W–SPE24型，北京萊伯泰科儀器股份有限公司。

氮吹儀：912b型，美國Organomation 公司。

土霉素、四環(huán)素、金霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）分別不小于96.5%、94.2%、99.5%，德國Dr.Ehrenstorfer公司。

甲醇、乙腈：均為色譜純，美國瑞米克公司。

磷 酸 氫 二 鈉–檸 檬 酸 緩 沖 液：pH值 為6.8±0.05，將1 000 mL 0.4 mol／L磷酸氫二鈉溶液與294 mL 0.2 mol／L 檸檬酸溶液混勻。

甲醇–水溶液（5+95）：量取5 mL 甲醇與95 mL 水混勻。

草酸–甲醇溶液：0.01 mol／L，稱取1.30 g 草酸（C2H2O4·2H2O），用甲醇溶解，定容至1 000 mL。

乙腈–甲醇混合溶液：乙腈與甲醇體積比為1∶1的混合溶液。

實驗所用其它試劑均為分析純。

實驗用水為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的土霉素、四環(huán)素、金霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別用甲醇溶解、稀釋和定容，配制成2 mg／mL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于0～4 ℃保存。

分別吸取5.0 mL土霉素、四環(huán)素、金霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液至100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至標(biāo)線，混勻，各組分的質(zhì)量濃度均為100 μg／mL，該混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于4 ℃保存，然后按需求稀釋成不同的濃度。

1.2.2 Na2EDTA–Mcllvaine –甲醇提取液

稱取37.22 g Na2EDTA·2H2O，用水溶解，定容至1 000 mL，與磷酸氫二鈉–檸檬酸緩沖液及甲醇按體積比1∶1∶2混勻，用NaOH溶液或HCl溶液調(diào)節(jié)pH值為7.20±0.05。

1.2.3 樣品采集

土壤樣品采集后去除雜質(zhì)，在室溫條件下自然風(fēng)干，粉碎，過0.25 mm篩，密封，于–18 ℃冷凍保存。

1.2.4 樣品處理

抗生素提?。悍Q取過篩樣品1.0～2.0 g（精確至0.1 g）于50 mL離心管中，加入20 mL Na2EDTA–Mcllvaine–甲醇提取液，振蕩20 min，以3 500 r／min轉(zhuǎn)速離心10 min，重復(fù)提取兩次，合并上清液并定容至50 mL。

固相萃?。狠腿≈? mL甲醇及5 mL水活化。取上述上清液5 mL，以1.0 mL／min流量過HLB柱，用5 mL甲醇–水溶液（5+95）淋洗固相萃取柱，真空抽干后用5 mL草酸–甲醇溶液洗脫，于40 ℃下氮吹濃縮至體積小于0.5 mL，用2 mL草酸–甲醇溶液溶解殘渣，過0.22 μm濾膜后進樣測定。

1.2.5 液相色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm，4.6 μm，美國安捷倫科技有限公司)；柱溫：30 ℃；進樣體積：20 μL；檢測波長：355 nm。流動相及梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相及梯度洗脫條件

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 流動相的選擇

用于高效液相色譜流動相的水相通常使用緩沖溶液，例如0.01 mol／L 的草酸溶液，草酸能與金屬離子螯合，有效消除金屬離子對四環(huán)素類抗生素分析的干擾。甲醇是最常見的有機溶劑且在紫外波段吸收較低。乙腈洗脫能力較強，其在紫外波段的吸收低于甲醇，且在相同流量下不會增大色譜柱壓，因而被廣泛采用［13］。因此，本實驗采用乙腈–甲醇溶液和0.01 mol／L 的草酸溶液作為流動相。

調(diào)整流動相中水相與有機相的比例進行試驗，當(dāng)0.01 mol／L的草酸溶液與乙腈–甲醇溶液的體積比為65∶35時，總分析時間大幅縮短，但土霉素與四環(huán)素的分離度較低，影響準(zhǔn)確定量。最終選擇乙腈–甲醇溶液（體積比為1∶1）與0.01 mol／L草酸水溶液的體積比為16∶84，采用表1梯度洗脫程序，分離效果最佳，3種四環(huán)素類抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1所示。由圖1可知，3種四環(huán)素類抗生素在32 min內(nèi)可實現(xiàn)較好的分離，色譜峰峰形尖銳，有良好的對稱性，適于準(zhǔn)確定量。

圖1 土霉素、四環(huán)素、金霉素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.1.2 檢測波長選擇

通過VWD紫外檢測器檢測掃描，分析3種四環(huán)素類抗生素的光譜，發(fā)現(xiàn)各物質(zhì)在250～480 nm內(nèi)有較強的紫外吸收。為了兼顧各抗生素均有較高的靈敏度，選擇355 nm 為吸收波長［14–15］。

2.2 線性方程及檢出限

配制系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在1.2.5色譜條件下進行測定，以各抗生素質(zhì)量濃度X（μg／mL）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)進行線性回歸，計算線性方程和相關(guān)系數(shù)，線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)列于表2。由表2可知，各抗生素質(zhì)量濃度在0.1～20.0 μg／mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 6。

表2 相關(guān)系數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程及線性范圍

將不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入到空白土壤樣品中，用本方法進行測定，每個水平重復(fù)檢測11次，按照文獻［16］計算方法檢出限和定量限，所得結(jié)果列于表3。由表3可知，本方法3種抗生素的檢出限分別為0.54、0.66、0.83 mg／kg。

表3 方法檢出限和定量限

2.3 加標(biāo)回收試驗

分別選擇土壤樣品A、B、C，按照1.2.4方法處理，在1.2.5色譜條件下進樣分析，結(jié)果均未檢測出土霉素、四環(huán)素、金霉素。向土壤樣品中分別添加16.7、100、500 mg／kg 3個濃度水平的土霉素、四環(huán)素、金霉素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，重新處理并測定6次，加標(biāo)樣品色譜圖如圖2所示，計算測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和加標(biāo)回收率，結(jié)果列于表4。

圖2 加標(biāo)土壤樣品色譜圖

表4 3種抗生素的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6） %

由圖2可知，土壤樣品中3種四環(huán)素類抗生素分離良好，土壤基質(zhì)無干擾。由表4可知，3種四環(huán)素類抗生素測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.75%～4.99%（n=6），樣品的加標(biāo)回收率為71.7%～ 97.3%，表明本方法具有良好的精密度，且準(zhǔn)確度較高，能滿足樣品分析要求。

3 結(jié)語

采用固相萃取處理樣品，建立了超高效液相色譜法測定土壤中土霉素、四環(huán)素和金霉素3種四環(huán)素類抗生素的檢測方法。樣品使用Na2EDTA–Mcllvaine –甲醇提取液，以HLB固相萃取柱凈化。該方法重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，對實現(xiàn)土壤中四環(huán)素類抗生素殘留監(jiān)控具有重要的意義。