閆學(xué)莉，高明偉，王志強(qiáng)，李建偉，李星星，李超

（1.山西省呂梁市中心血站，山西 呂梁 033000；2.山西省呂梁市人民醫(yī)院，山西 呂梁 033000；3.山西省醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，山西 太原 030000）

0 引言

人類血小板特異性抗原（Human Platelet Alloantigens,HPA）是表達(dá)在血小板膜糖蛋白（GP）上的抗原表位[1]，是血小板本身固有的抗原，主要分布 在GP Ⅱb，GP Ⅲa，GPIa，GPIbCD109 上[2]，此抗原是由遺傳決定的[3]，為常染色體雙等位基因共顯性遺傳[4]。其基因頻率在不同種族、不同地域分布各不相同。近年來，隨著成分輸血的開展，血小板輸注多用于防止和治療血小板減少癥或血小板功能缺損病人的輸血，輸注過程中可能會因為HPA 不相容會引起血小板同種免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生血小板同種抗體[5]，引起胎兒或新生兒出現(xiàn)一系列輸血不良反應(yīng)。對山西省呂梁市血小板特異性抗原基因多態(tài)性研究，為其提供有效指導(dǎo)，減少輸血不良反應(yīng)的發(fā)生。本研究評估了山西呂梁地區(qū)400 名漢族人HPA 基因多態(tài)性分布，彌補(bǔ)了該地區(qū)此項研究的空白，探討了血小板同型輸注的可能性，以期對該地區(qū)血小板采集和治療提供指導(dǎo)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

山西省呂梁市本地漢族人群，樣本為呂梁市中心血站隨機(jī)血液標(biāo)本400份，樣本儲存于EDTA抗凝管中，所有研究對象均無血緣關(guān)系和血液制品輸注史。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

Applied Biosystems 公司PCR 儀、北京六一生物科技有限公司DYY-6D 電泳儀，美國Syngene 核酸凝膠成像系統(tǒng)。

1.2.2 試劑

試劑盒選擇由北京solarbio 提供的全血基因組DNA、Taq 酶等。

1.3 全血基因組提取

使用紅細(xì)胞裂解液對樣本進(jìn)行處理，處理后的樣本利用柱膜法提取基因組DNA，并對提取的DNA 進(jìn)行質(zhì)控，DNA 濃度OD260/OD280 在1.8～2.0 時為合格。

1.4 DNA 擴(kuò)增

利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對樣本DNA 進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系20μL：Buffer 2μL，dNTPs 1.5μL（2.5μM），正反向擴(kuò)增引物各1μL，Taq DNA 聚合酶0.1μL（5U/μL），ddH2O 13.5μL，DNA 1μL。引物以相關(guān)文獻(xiàn)為參考，由上海生工生物有限公司合成。HPA 1、2、3、4、5、6、15 擴(kuò)增條件：①95℃預(yù)變性5min；②95℃變性30s，退火溫度分別為56.9℃、55.6℃、61.1℃、54.3℃、50℃、58.8℃、49℃，退火30s，72℃延伸90s，30 個循環(huán)；③72℃延伸5min；降溫至4℃擴(kuò)增完成。

1.5 核酸電泳及凝膠成像

吸取1μL DNA loading buffer 以及5μL PCR 產(chǎn)物，隨后將其混勻+瓊脂糖凝膠1.0%電泳，最后再把凝膠放置在凝膠成像儀中成像分析，對其實驗結(jié)果加以保存。

1.6 數(shù)據(jù)處理及分析

按照遺傳學(xué)基因計數(shù)方法計算基因頻率。

2 實驗結(jié)果

2.1 HPA 基因分型

具體結(jié)果見圖1（以其中的1 號標(biāo)本為例對結(jié)果進(jìn)行展示）。

圖1 HPA 分型結(jié)果

2.2 HPA 基因型以及基因頻率

按照Hardy-Weinberg 定律，分析以上400 例標(biāo)本群體遺傳結(jié)構(gòu)分化、基因頻率與概率、與分化，見表1。

表1 HPA 1-6，15 基因頻率計算

3 討論

血小板抗原主要分為兩大類：一類是在其他組織或細(xì)胞中也存在的抗原，如紅細(xì)胞的ABO 類抗原和人類組織相容性復(fù)合體HLA-I 類抗原；另一類是人類血小板本身特有的抗原，即血小板特異性抗原[6]。自從1959 年第一個人類血小板特異性抗原被鑒定以來，使用人血清免疫性同種抗體鑒定的方法，至今共發(fā)現(xiàn)24 種血小板抗原[7]。其中22 個抗原被血小板命名委員會（PNC）正式命名，命名原則以HPA 為字頭連接數(shù)字。在等位基因組成的遺傳統(tǒng)計中，不同基因型相對應(yīng)的用小寫英文字母a 和b 分類，a 代表基因頻率大于50%的等位基因，b 代表基因頻率小于50%的等位基因，當(dāng)未發(fā)現(xiàn)等位基因時，基因型用w 表示。22 個正式命名的抗原受控于在人類第5、6、17 和22 號染色體上的6 個遺傳位置[8]。除HPA14bw基因為缺失三個堿基的整碼突變，其余遺傳多態(tài)性均為錯義突變（SNP）[9]。

HPA 等位基因不管整碼突變還是錯義突變，都會導(dǎo)致所編碼的氨基酸的改變，從而引起膜蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，產(chǎn)生不同的抗原性。

近年來臨床血小板輸注治療在多種出血性疾病中的廣泛應(yīng)用，使得發(fā)生血小板同種免疫致敏的概率越來預(yù)高[10]。患者如果要進(jìn)行血小板輸注時，針對性的進(jìn)行血小板HPA 基因型檢測，找與其相適應(yīng)的同型血小板。這樣就能夠有效的避免因血小板抗原性不合造成的輸血不良反應(yīng)[11]。因此，人類血小板抗原的遺傳多態(tài)性的研究對于指導(dǎo)臨床血小板輸血具有極其重要的意義[12]。

本研究通過SSP-PCR 技術(shù)對呂梁地區(qū)漢族人群HPA1-17 進(jìn)行多態(tài)性研究，結(jié)果顯示，HPA 1-6，15呈現(xiàn)多態(tài)性，而在其他位點中只檢出a 基因。此結(jié)果與國內(nèi)各地區(qū)對HPA 多態(tài)性研究基本一致[13-14]。

綜上所述，呂梁地區(qū)HPA 基因有其本身的地域特點，此研究將會為呂梁地區(qū)血小板輸注治療提供幫助。同時為研發(fā)適用于該地區(qū)的HPA 基因分型檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。