蔡 睿，王振興，安 南，賀云靖，楊文卓，王 星，許哲男*

（1.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，長春 130012；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院胸外科，長春 130033）

肺癌是呼吸系統(tǒng)常見的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率和致死率已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問題[1]。非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是肺癌中常見的一種分型[2]。隨著診療技術(shù)的發(fā)展和改進(jìn)，NSCLC的總體生存率有所提升，但其5年生存率仍處于較低水平[3]。目前NSCLC發(fā)生早期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不清楚，研究[4]發(fā)現(xiàn)，外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞間信號傳導(dǎo)在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。本研究主要通過對NSCLC轉(zhuǎn)移和非轉(zhuǎn)移患者血清外泌體進(jìn)行提取、分離、測序以及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方式，闡述血清中微小RNA（miRNA）對NSCLC早期轉(zhuǎn)移潛在的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 外泌體提取和分離

隨機(jī)收集就診于我院胸外科的2例NSCLC轉(zhuǎn)移患者全血10 mL，2例NSCLC未轉(zhuǎn)移患者全血10 mL以及2例健康體檢患者全血10 mL。同期選取30例NSCLC轉(zhuǎn)移患者和30例NSCLC未轉(zhuǎn)移患者進(jìn)行實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)驗(yàn)證基因芯片準(zhǔn)確性。4℃下1 900 g離心10 min，搜集上層血漿并在4℃下3 000 g離心15 min，搜集上清液進(jìn)行外泌體提取。提取方法選擇超高速離心法，即3 00 g條件下離心10 min，搜集上清并進(jìn)行2 000 g條件下離心10 min，搜集上清并進(jìn)行10 000 g條件下離心30 min，搜集上清并進(jìn)行100 000 g條件下離心70 min，最終沉淀物即為外泌體。

1.2 外泌體的基因芯片測序

TRIzol法提取6例樣本外泌體中的RNA，應(yīng)用NanoDrop ND-1000進(jìn)行RNA濃度和純度的檢測。用含T4連接酶的cyanine 3-pCp標(biāo)記miRNA，通過濃縮和干燥標(biāo)記的cRNA然后被重懸。在11 uL體積10×阻斷劑和2.2 uL的25×裂解緩沖液中培養(yǎng)30 min并添加55 uL雜交緩沖液，最終清洗、固定和掃描。

1.3 外泌體測序結(jié)果驗(yàn)證

隨機(jī)選取就診于我院的30例NSCLC轉(zhuǎn)移患者和30例NSCLC未轉(zhuǎn)移患者，取全血10 mL，進(jìn)行外泌體的分離和提取。外泌體應(yīng)用蛋白電泳和電子顯微鏡進(jìn)行檢測。應(yīng)用百泰克miRNA提取試劑盒進(jìn)行外泌體中miRNA的提取，應(yīng)用吉瑪miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒對差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 NSCLC患者血清外泌體中RNA質(zhì)量檢測

見表1，圖1。

表1 外泌體中RNA濃度和純度的檢測

圖1 外泌體中RNA質(zhì)量以及芯片檢測

2.2 NSCLC患者血清外泌體miRNA芯片檢測結(jié)果

見圖2。

圖2 血清外泌體miRNA芯片檢測

2.3 外泌體差異表達(dá)miRNA檢測結(jié)果

見圖3，表2。

圖3 血清外泌體鑒定

表2 血清外泌體miRNA芯片實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果（±s，n= 30）

表2 血清外泌體miRNA芯片實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果（±s，n= 30）

注：與腺癌轉(zhuǎn)移比較，# P＜ 0.05

樣本 腺癌轉(zhuǎn)移（CT值）腺癌未轉(zhuǎn)移（CT值） 差異倍數(shù)miR-4436a 32.80±2.75 34.52±3.52# 2.11 miR-4687-5p 33.06±2.88 34.79±3.33# 2.09 miR-22-3p 31.96±1.05 31.41±1.02# 0.43 miR-3666 31.00±1.25 30.36±1.12# 0.41 miR-4448 33.05±1.45 32.36±1.18# 0.39 miR-4449 32.81±0.99 32.35±0.58# 0.46 miR-6751-5p 31.78±0.69 31.29±0.88# 0.45 miR-92a-3p 30.37±0.86 29.74±1.03# 0.41

3 討論

外泌體是一種納米級別的雙層膜結(jié)構(gòu)，其內(nèi)包含有大量的生物活性物質(zhì)如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸[5]。外泌體可以由各種活細(xì)胞分泌，并被靶細(xì)胞攝取，完成細(xì)胞間的生物信息傳遞以及調(diào)控。近年來研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可能參與肺癌特別是NSCLC的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。另外，外泌體廣泛分布于血液、尿液、腦脊液以及胸水中[4]，這就為其成為診斷標(biāo)志物提供便利條件。故本文通過對NSCLC患者血清中外泌體的提取、分離、測序以及驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，血清外泌體中miR-4436a，miR-4687-5p，miR-22-3p，miR-3666，miR-4448，miR-4449，miR-6751-5p，miR-92a-3p可以作為NSCLC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的診斷標(biāo)志物。

微小RNA（miRNA）是一種長度大約為22 nt的非編碼RNA，被認(rèn)為可能參與到多種腫瘤的生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病理學(xué)過程[6]。血液中游離的miRNA較易受到酶的分解，因此直接檢測血液中游離的miRNA誤差較大，很難作為臨床診療標(biāo)志物進(jìn)行廣泛開展[7]。外泌體具有雙側(cè)脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，能夠有效的保護(hù)其內(nèi)搭載的miRNA不被血液中酶分解。因此檢測血液外泌體中的miRNA可能對NSCLC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供早期的診斷信息[8-9]，進(jìn)而指導(dǎo)臨床治療。

既往文獻(xiàn)報道肺癌外泌體可能參與肺癌細(xì)胞的快速增殖、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、放射性抵抗以及藥物抵抗等病理生理學(xué)過程。研究[10]發(fā)現(xiàn)外泌體中miR-1247-3p誘導(dǎo)癌相關(guān)成纖維細(xì)胞活化進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移。研究[11]發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞分泌的包含miR-23a的外泌體可以通過靶向緊密連接蛋白ZO-1增加新生血管生成和血管通透性，進(jìn)而促進(jìn)肺癌的轉(zhuǎn)移。研究[12]通過對NSCLC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和未轉(zhuǎn)移患者血清中外泌體進(jìn)行miRNA基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)miR-4448可能參與NSCLC的早期轉(zhuǎn)移。研究[13]發(fā)現(xiàn)外泌體中長鏈非編碼RNA-MMP2-2能夠通過靶向調(diào)控MMP2的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

本研究通過對4例NSCLC患者血清中外泌體測序，發(fā)現(xiàn)NSCLC發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者血清外泌體中miR-4436a，miR-4687-5p呈現(xiàn)差異性上調(diào)表達(dá)，miR-22-3p，miR-3666，miR-4448，miR-4449，miR-6751-5p，miR-92a-3p呈現(xiàn)差異性下調(diào)表達(dá)，提示這8種外泌體中miRNA對NSCLC早期轉(zhuǎn)移具有潛在的診療價值。miRNA基因芯片能夠快速檢索樣本中差異表達(dá)的miRNA，速度快、成本低，但是其準(zhǔn)確性尚需要結(jié)合實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。因此，我們通過吉瑪公司進(jìn)行上述8種引物的合成，并通過實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)在10例NSCLC未轉(zhuǎn)移以及NSCLC轉(zhuǎn)移的患者血液外泌體中進(jìn)行驗(yàn)證，最終確認(rèn)這8種外泌體中的miRNA發(fā)生差異性表達(dá)，和基因芯片檢測結(jié)果一致。

綜上所述，肺癌患者血清外泌體中miR-4436a，miR-4687-5p呈現(xiàn)差異性上調(diào)表達(dá)，miR-22-3p，miR-3666，miR-4448，miR-4449，miR-6751-5p，miR-92a-3p呈現(xiàn)差異性下調(diào)表達(dá)，檢測這8種血清標(biāo)志物可以對NSCLC的早期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移起到提示作用，指導(dǎo)臨床藥物治療。但本研究尚有一定的局限性，測序樣本較少可能存在結(jié)果偏倚，更大樣本的測序以及更多樣本的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證應(yīng)該在后續(xù)研究中繼續(xù)開展。