李雙雙，呂佳琦，李 媛，趙玙璠，滕玉鷗，李明媛,2

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.天津市透明質(zhì)酸應(yīng)用研究企業(yè)重點實驗室，天津市康婷生物工程集團(tuán)有限公司，天津300380)

乳腺癌是全球女性癌癥發(fā)病率最高的一種惡性腫瘤[1-3].目前，乳腺癌的治療方法主要有手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療、內(nèi)分泌治療、靶向治療及免疫治療等[4].其中，化學(xué)治療是治療乳腺癌常用的方法之一.由于單藥化療的使用有限，因此藥物聯(lián)合治療的方式在臨床上應(yīng)用廣泛[5-9].

根據(jù)國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(national comprehensive cancer network，NCCN)的指南，帕布昔利布(palbociclib，Pal)和氟維司群(fulvestrant，F(xiàn)ul)組合被推薦為聯(lián)合治療乳腺癌的方案之一[10-11].帕布昔利布能夠選擇性地抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶 4和 6(cyclindependent kinase 4/6，CDK4/6)，是一種 CDK4/6抑制劑[12-14].它能恢復(fù)細(xì)胞周期控制，阻斷腫瘤細(xì)胞增殖，為美國 FDA批準(zhǔn)的首個 CDK4/6抑制劑[15].氟維司群是一種純粹的雌激素受體(estro-gen receptor，ER)拮抗劑，沒有部分雌激素樣激動效應(yīng)，通過結(jié)合、阻斷并下調(diào) ER，從而抑制雌激素信號通路，能與 ER競爭性結(jié)合，與ER的親和力接近雌激素[16-17].

然而，臨床使用中的傳統(tǒng)組合只是一種簡單混合.由于藥物的理化性質(zhì)、藥物代謝動力學(xué)性質(zhì)的不同，簡單地將兩種藥物混合在一起使用具有局限性.為了克服這些局限性，將兩種藥物共同遞送到腫瘤細(xì)胞中至關(guān)重要.在納米載體中，脂質(zhì)體[18-20]具有廣闊的應(yīng)用前景.脂質(zhì)體是一種具有緩釋作用的載體[21]，通過實體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)改善腫瘤組織中的藥物積累以及降低藥物對正常組織的毒性[22].此外，脂質(zhì)體的內(nèi)水相可以包封親水性藥物，脂溶性藥物則可包封于磷脂雙分子層間，使其可用于親水和疏水藥物的共同遞送.帕布昔利布的油水分配系數(shù)(logP)為 0.99，具有一定的親脂性和水溶性，可使用薄膜分散法將其包載于脂質(zhì)體的磷脂雙分子層之間和內(nèi)水相.氟維司群的 logP為 8.9，為脂溶性藥物，被脂質(zhì)體包載時，可使用薄膜分散法被包載于脂質(zhì)體的磷脂雙分子層之間.陽離子脂質(zhì)體(cationic liposomes，CLs)是帶正電荷的近球形囊泡，主要由陽離子脂質(zhì)組成，可有效地包載藥物.CLs因其表面帶有正電荷，可以與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜發(fā)生靜電作用，進(jìn)而被細(xì)胞膜吸附，促進(jìn)其被細(xì)胞攝取的能力，然后通過細(xì)胞內(nèi)吞或者膜融合方式將藥物導(dǎo)入細(xì)胞而發(fā)揮作用.本研究旨在制備帕布昔利布和氟維司群共載藥陽離子脂質(zhì)體(Pal-Ful-CLs)，通過陽離子脂質(zhì)體共同遞送化學(xué)治療藥物帕布昔利布和氟維司群，以提高治療乳腺癌的療效.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

帕布昔利布(純度 99%，批號 HW20E1401-1)，北京華威銳科化工有限公司；氟維司群(純度≥99%，批號 G01S8Z42903)，上海源葉生物科技有限公司；二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE，批號 S03005)、(2，3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP，批號 001004)，艾偉拓(上海)醫(yī)藥科技有限公司；甲醇為色譜純，氯仿、二乙胺和磷酸為分析純，水為蒸餾水，其他試劑均為分析純.

UV-2550 PC型紫外分光光度計，美國 Thermo Fisher Scientific公司；PB150Z-S型電子天平，島津國際貿(mào)易有限公司；RE-3000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHI-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵，上海亞榮生化儀器廠；SB-3200D型超聲波清洗儀、SCIENTZ-II D型超聲波細(xì)胞粉碎機，寧波新芝科技有限公司；TGL-20M 型臺式冷凍離心機，湘儀離心機有限公司；1200型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；Model 3100 series型CO2培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技公司；YXQ-LS-50SI型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司；Nano-ZS90型粒度儀，英國Malvern公司.

1.2 帕布昔利布和氟維司群陽離子脂質(zhì)體的制備

1.2.1 空白陽離子脂質(zhì)體的制備

分別稱取 DOTAP與 DOPE(物質(zhì)的量比 1∶3，質(zhì)量分別為 6.98、22.32mg)混合磷脂于茄形瓶中，加入 3mL有機溶劑(氯仿、甲醇)溶解，37℃減壓旋蒸除去有機溶劑，茄形瓶瓶底形成蜂窩狀薄膜.常溫真空干燥后取下茄形瓶，向茄形瓶中加入2.93mL水化液(DEPC處理水)，50℃水化薄膜，制備為總磷脂質(zhì)量濃度為 10mg/mL的陽離子脂質(zhì)體.超聲使脂質(zhì)體粒徑均勻，用 0.45μm、0.22μm 無菌濾膜過濾，得到空白脂質(zhì)體，4℃保存.

1.2.2 載藥陽離子脂質(zhì)體的制備

分別稱取 DOTAP與 DOPE(物質(zhì)的量比 1∶3，質(zhì)量分別為 6.98、22.32mg)混合磷脂、0.76mmol/L帕布昔利布 1mg、0.56mmol/L氟維司群 1mg于茄形瓶中，加入 3mL有機溶劑(氯仿、甲醇)溶解.按1.2.1節(jié)的薄膜分散法制得Pal-Ful-CLs，4℃保存.

1.3 帕布昔利布和氟維司群含量測定方法的建立

1.3.1 紫外吸收全波長掃描

分別稱取2mg Pal和2mg Ful標(biāo)準(zhǔn)品于2mL容量瓶中，加流動相定容，分別得 1mg/mL溶液；再稀釋至適宜濃度，過濾后待用.取適量樣品溶液于石英比色皿中，使用紫外分光光度計進(jìn)行全波長掃描(波長 190～400nm)[23].

1.3.2 色譜分析與專屬性

帕布昔利布色譜條件：色譜柱 Eclipse XDBC18(4.6mm×150mm，5μm)，流動相為乙腈與水(含0.1% 三氟乙酸)，體積比為 25∶75，流量 1mL/min，柱溫30℃，檢測波長280nm，進(jìn)樣量20μL.

氟維司群色譜條件：色譜柱 Eclipse XDBC18(4.6mm×150mm，5μm)，流動相為甲醇、乙腈和水(含 0.1% 三氟乙酸)，體積比為 70∶7.5∶22.5，流量 1mL/min，柱溫 30℃，檢測波長 220nm，進(jìn)樣量20μL.

專屬性：分別稱取10mg帕布昔利布與氟維司群標(biāo)準(zhǔn)品于不同的 10mL容量瓶中，流動相定容、搖勻，分別得 1mg/mL帕布昔利布與氟維司群標(biāo)準(zhǔn)樣品儲備液，取儲備液分別依次稀釋定容至 30μg/mL作為對照品.移取空白脂質(zhì)體破膜后作為空白脂質(zhì)體供試品，移取 Pal-Ful-CLs破膜后作為共載藥脂質(zhì)體供試品.在色譜條件下檢測樣品，分析色譜圖，記錄各樣品出峰保留時間.

1.3.3 破膜劑的選擇

破膜劑選擇能高效破膜且不會對藥物測定造成干擾的溶劑.傳統(tǒng)脂質(zhì)體破膜常用甲醇、無水乙醇和5%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液.考察比較了甲醇、無水乙醇和5% SDS溶液破膜的效果.取2mL容量瓶9個，各加入 Pal-Ful-CLs 100μL，再依次加入甲醇、無水乙醇和 5% SDS溶液各 100、200、500μL，旋渦振蕩輔助破膜，待無丁達(dá)爾效應(yīng)說明破膜完全.

1.3.4 線性及范圍

分別稱取 10mg帕布昔利布與氟維司群標(biāo)準(zhǔn)品于不同的 10mL容量瓶中，流動相定容、搖勻，得1mg/mL帕布昔利布與氟維司群標(biāo)準(zhǔn)樣品儲備液.取儲備液依次稀釋定容得 500、300、200、100、50、25、10μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液.在1.3.2節(jié)高效液相色譜條件下進(jìn)樣，計算峰面積，繪制峰面積(y)與濃度(x)關(guān)系圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.3.5 重復(fù)性、精密度與回收率

重復(fù)性：分別稱取帕布昔利布與氟維司群標(biāo)準(zhǔn)品10mg于不同的 10mL容量瓶中，加流動相定容、搖勻，得 1mg/mL帕布昔利布與氟維司群標(biāo)準(zhǔn)樣品儲備液.將樣品溶液逐級稀釋，平行制得 50μg/mL兩種樣品溶液各6份.在1.3.2節(jié)高效液相色譜條件下檢測樣品，分析記錄峰面積，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值.

精密度：分別稱取Pal和Ful標(biāo)準(zhǔn)品10mg于不同的 10mL容量瓶中，加流動相定容、搖勻，得1mg/mL帕布昔利布與氟維司群標(biāo)準(zhǔn)樣品儲備液.將樣品溶液逐級稀釋，各得 50μg/mL樣品溶液.在1.3.2節(jié)高效液相色譜條件下兩種樣品各連續(xù)進(jìn)樣 6次分析.

回收率：分別精密量取 0.3、0.4、0.5mL Pal儲備液于 3個 10mL容量瓶中，接著加入處方比例的空白脂質(zhì)體，再加500μL乙醇破壞脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，流動相稀釋定容，即為供試品.Ful供試品的制備同 Pal.將上述供試品在1.3.2節(jié)高效液相色譜條件下進(jìn)樣分析.

1.3.6 樣品穩(wěn)定性

取Pal-Ful-CLs破膜后于室溫下保存，按照1.3.2節(jié)色譜條件，于 0、1、2、4、6、8、10、12h 進(jìn)樣測定，計算RSD值.

1.3.7 檢測限與定量限

分別稱取適量的 Pal和 Ful，用流動相進(jìn)行倍比稀釋，從低濃度到高濃度依次進(jìn)樣，在 1.3.2節(jié)色譜條件下測定樣品峰面積.當(dāng)信噪比S/N為3時，進(jìn)樣藥物濃度即為樣品檢測限；當(dāng)信噪比 S/N為 10時，進(jìn)樣藥物濃度即為樣品定量限.

1.4 帕布昔利布和氟維司群陽離子脂質(zhì)體表征

1.4.1 包封率

分別取100μL Pal-Ful-CLs于2個2mL容量瓶中，一份加適量乙醇振蕩破壞脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，流動相定容，利用 1.3.2節(jié)高效液相檢測方法測定脂質(zhì)體總藥濃度 Cy；另一份直接加去離子水稀釋定容，取其500μL置于截留相對分子質(zhì)量為 3.0×104的超濾器離心管中，以離心力 11180g超濾離心 10min，收集下層濾液，利用 1.3.2節(jié)高效液相檢測方法測定超濾液中兩個游離藥物濃度 Cx.分別按式(1)和式(2)計算脂質(zhì)體包封率和載藥量[24-25].

1.4.2 粒徑和電位

將脂質(zhì)體用去離子水稀釋適當(dāng)倍數(shù)后制得待測品，在比色皿中加入 1～1.5mL待測品，置于馬爾文粒度儀中，在(25±1)℃條件下利用動態(tài)光散射技術(shù)測定粒徑、多分散指數(shù)(PDI)和電位.每個樣品連續(xù)測量3次，計算平均值.

1.4.3 脂質(zhì)體形態(tài)

將 Pal-Ful-CLs適當(dāng)?shù)叵♂尯?，在銅網(wǎng)上滴加20μL脂質(zhì)體樣品，其中多余的液體用濾紙吸去并自然晾干，在風(fēng)干處滴加磷鎢酸染3s，利用透射電子顯微鏡(TEM)掃描成像.

2 結(jié)果與分析

2.1 帕布昔利布和氟維司群含量測定方法學(xué)

2.1.1 紫外全波長掃描

Pal溶液和 Ful溶液紫外全波長掃描圖見圖1，280nm處為 Pal最大吸收峰，220nm處為 Ful最大吸收峰，故分別選擇280nm和220nm為Pal和Ful含量測定的紫外檢測波長.

圖1 Pal溶液和Ful溶液紫外全波長掃描圖Fig.1 Ultraviolet full-wavelength scan of Pal and Ful

2.1.2 破膜實驗

由于所制備的脂質(zhì)體的粒徑小于入射光波長(400～700nm)，發(fā)生光的散射，這種光的散射現(xiàn)象就稱為丁達(dá)爾效應(yīng).當(dāng)用一束光照射加入破膜劑后的體系時，出現(xiàn)光路則未破膜或未完全破膜.當(dāng) Pal-Ful-CLs中分別加入 100μL、200μL 和 500μL 破膜劑(甲醇、無水乙醇和 5% SDS)后，觀察到只有加入500μL無水乙醇后未出現(xiàn)光路，則說明破膜完全，故選擇每 100μL脂質(zhì)體中加入 500μL無水乙醇進(jìn)行破膜.

2.1.3 專屬性

專屬性實驗結(jié)果如圖2所示.

圖2 Pal和Ful專屬性實驗結(jié)果Fig.2 Specificity test results of Pal and Ful

Pal在9.8min左右出峰，F(xiàn)ul在10.3min左右出峰.在各自的液相條件下兩者均能完全分開，互無影響.同時，空白脂質(zhì)體中的磷脂材料在 9.8min和10.3min左右均不出峰，對于測定無影響.

2.1.4 線性及范圍

Pal在 10～500μg/mL的范圍內(nèi)線性良好，線性方程為 y＝57.864x＋66.972，R2＝0.9999，說明擬合度高，符合藥典要求.Ful在 10～500μg/mL的范圍內(nèi)線性良好，線性方程為 y＝11.978x＋10.768，R2＝1，說明擬合度高，符合藥典要求.

2.1.5 重復(fù)性、精密度和回收率實驗

在精密度實驗中，同一樣品連續(xù)進(jìn)樣 6次，Pal和Ful峰面積RSD均在2.0%范圍內(nèi)，說明測定方法的精密度好，符合藥典要求；在重復(fù)性實驗中，重復(fù)進(jìn)樣6次，Pal和Ful峰面積RSD均在2.0%范圍內(nèi)，說明測定方法的重復(fù)性好，符合藥典要求；在回收率實驗中，Pal和 Ful的回收率均在 98.0%～102.0%的范圍內(nèi)，且RSD均在2.0%范圍內(nèi)，回收率良好.

2.1.6 樣品穩(wěn)定性

測定 Pal-Ful-CLs破膜后 12h內(nèi)峰面積，Pal和Ful的 RSD值分別為 1.83%和 1.73%，均在 2.0%范圍內(nèi)，樣品穩(wěn)定性良好.

2.1.7 檢測限與定量限

Pal檢測限為 25ng，定量限為 30ng；Ful檢測限為500ng，定量限為1μg.

2.2 脂質(zhì)體性質(zhì)評價

超濾離心法測得Pal和Ful脂質(zhì)體的包封率分別為 31.20%和 100.00%.由于 Pal的 logP為 0.99，在0～3之間，具有脂溶性和水溶性，其與磷脂之間的相互作用弱，容易滲漏，導(dǎo)致包封率低.因此，在后續(xù)的實驗中，考慮制備較高濃度的脂質(zhì)體，用以增加內(nèi)水相體積所占比率，從而提高其包封率.而Ful的logP為 8.9，具有強親脂性，與磷脂具有強烈的相互作用，使脂質(zhì)體不易滲漏，因此包封率高.圖3為陽離子脂質(zhì)體的粒徑和電位分布圖.Pal-Ful-CLs的平均粒徑為(182.13±3.56)nm，多分散系數(shù)為0.18±0.02(小于0.2)，表明分散度良好.Pal-Ful-CLs的電位為(57.1±2.6)mV，陽離子脂質(zhì)體表面的正電荷有利于脂質(zhì)體在體系中的分散均勻和穩(wěn)定.

圖3 脂質(zhì)體的粒徑和Zeta電位分布Fig.3 Particle size and Zeta potential distribution of liosomes

2.3 TEM表征脂質(zhì)體形態(tài)

通過透射電鏡觀察脂質(zhì)體形態(tài)(圖4)可見，Pal-Ful-CLs呈圓形且均勻分散，粒徑與粒度儀所測一致.

圖4 Pal-Ful-CLs的透射電鏡圖Fig.4 TEM image of Pal-Ful-CLs morphological study

3 討 論

藥物的聯(lián)合使用已經(jīng)在癌癥治療中引起了廣泛關(guān)注，耐藥性和腫瘤復(fù)發(fā)通常與基于單一藥物的癌癥化學(xué)療法相關(guān).乳腺癌是發(fā)生于乳腺上皮組織的惡性腫瘤，屬于激素依賴性腫瘤.若患者 ER屬陽性，則可為患者實施內(nèi)分泌輔助治療.Ful屬于新型雌激素受體下調(diào)劑，具有很好的臨床效果[26].內(nèi)分泌療法的作用機制可能與抑制 CDK4/6的活性部分相關(guān)，CDK4/6活化可能導(dǎo)致內(nèi)分泌治療耐藥，抑制CDK4/6活性的藥物與內(nèi)分泌治療藥物聯(lián)用可能會起協(xié)同作用[27].因此，F(xiàn)ul和 Pal的聯(lián)合使用可以提高治療乳腺癌的療效.然而，通過將兩種藥物簡單混合的方法控制腫瘤細(xì)胞的藥物比例和劑量具有挑戰(zhàn)性.本研究制備了一種陽離子脂質(zhì)體，能夠同時包載Ful和 Pal并共同遞送至腫瘤細(xì)胞，并對其性質(zhì)進(jìn)行了評估.

本研究首先使用紫外全波長掃描測定了 Pal和Ful的最大吸收峰，根據(jù)紫外全波長掃描圖選擇280nm和220nm為Pal和Ful含量測定的紫外檢測波長.在使用高效液相色譜法測定前，需要對脂質(zhì)體進(jìn)行破膜實驗，本研究分別用甲醇、無水乙醇和 5%SDS作為破膜劑，根據(jù)有無光路選擇以每 100μL脂質(zhì)體中加入 500μL無水乙醇進(jìn)行破膜.超濾離心法測得 Pal和 Ful脂質(zhì)體的包封率分別為 31.20%和100.00%.由于 Pal的包封率較低，在后續(xù)的實驗中，考慮制備較高濃度的脂質(zhì)體，用以增加內(nèi)水相體積所占比率，用以提高其包封率.Pal-Ful-CLs的平均粒徑為(182.13±3.56)nm，多分散系數(shù)為 0.18±0.02，表明分散度良好；Pal-Ful-CLs的電位為(57.1±2.6)mV，使脂質(zhì)體通過靜電斥力穩(wěn)定分散，同時陽離子脂質(zhì)體表面正電荷可以與帶負(fù)電荷的核酸藥物通過靜電吸附作用結(jié)合.因此，將化療藥物和核酸藥物進(jìn)行同時包載用于癌癥治療是下一步實驗研究的重要內(nèi)容.本研究制備的共載藥陽離子脂質(zhì)體粒徑均一、分散穩(wěn)定并且工藝重現(xiàn)性好，作為藥物共同遞送載體具有一定的應(yīng)用前景.