吳飄 寧珊 張鳳媛 黃榮韶 李良波 姜學(xué)松

摘? 要：以有柄石韋（Pyrrosia petiolosa）為材料，制備有柄石韋葉柄、營養(yǎng)葉、孢子葉、孢子囊和去孢子葉5個部位的70%乙醇提取物和水提取物，測定其綠原酸（Chl）、芒果苷（Man）、咖啡酸（Caf）、蘆?。≧ut）、總黃酮（TF）和總酚（TP）的含量以及抗氧化活性。結(jié)果表明：有柄石韋不同部位有效成分含量和抗氧化活性均有顯著性差異（P < 0.05）;去孢子葉的總黃酮和總酚含量最高，分別為（129.46 ± 4.03）mg/g和（47.85 ± 2.98）mg/g，與營養(yǎng)葉的含量相似;有柄石韋各部位醇提物的抗氧化活性均高于水提物;各部位抗氧化活性強弱順序為：營養(yǎng)葉>去孢子葉>孢子葉>葉柄>孢子囊;去孢子葉和營養(yǎng)葉的綠原酸和蘆丁含量較高;營養(yǎng)葉的芒果苷和咖啡酸含量最高，顯著高于其他4個部位（P < 0.05）;有柄石韋不同部位的ABTS+自由基清除能力、DPPH自由基清除能力及總抗氧化能力均與其有效成分含量呈正相關(guān)（r = 0.69～0.98）。綜合分析得知，有柄石韋營養(yǎng)葉的有效成分較多，具有較強的抗氧化活性，本研究結(jié)果可為石韋藥材的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：有柄石韋;總黃酮;總酚;抗氧化活性

中圖分類號：R284.1????? 文獻標(biāo)識碼：A

Comparative Analysis of the Active Component and Antioxidant Activity of Different Parts of Pyrrosia petiolosa

WU Piao1， NING Shan1， ZHANG Fengyuan1， HUANG Rongshao1，2*， LI Liangbo1，2*， JIANG Xuesong3

1. College of Agriculture， Guangxi University， Nanning， Guangxi 530004， China; 2. School of Pharmacy， Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning， Guangxi 530200， China; 3. Jiangxi Hongxing Pharmaceutical Co.， Ltd， Fuzhou， Jiangxi 331800， China

Abstract： The 70% ethanol extraction and water extraction solution were prepared from petioles， trophophylls， sporophylls， sporangia and sporophylls without sporangia of Pyrrosia petiolosa. The active ingredients and antioxidant activity in the extraction ， including chlorogenic acid （Chl）， mangiferin （Man）， caffeic acid （Caf）， rutin （Rut）， total flavonoids （TF）， total phenols （TP） were assayed. There were significant differences among the five parts for active ingredients and antioxidant activity （P<0.05）. TF and TP in sporophylls without sporangia were the highest， （129.46±4.03）mg/g and （47.85±2.98）mg/g respectively， which was similar to trophophylls. The antioxidant activity of ethanol extraction was higher than that of water extraction in each part. The antioxidant activity of each part was trophophylls > sporophylls without sporangia > sporophylls > petiole > sporangia. Chl and Rut in sporophylls without sporangia and trophophylls were higher. Man and Caf acid in trophophylls were the highest， which was significantly higher than that of the other four parts （P<0.05）. Besides， the ABTS+ free radical scavenging capacity， DPPH free radical scavenging abilities and total antioxidant capacity of different parts of P. petiolosa were positively correlated with active components （r=0.69～0.98）. According to the comprehensive analysis， trophophylls had more effective components and stronger antioxidant activity. The study could provide scientific basis for the development and utilization of Pyrrosia.

Keywords： Pyrrosia petiolosa; total flavonoids; total phenols; antioxidant activity

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.07.033

自由基對人體健康影響極大，可損害機體的組織和細胞，引起衰老，誘發(fā)癌癥、動脈粥樣硬化等多種疾病[1]。凡能夠干擾自由基連鎖反應(yīng)的引發(fā)或擴散過程、抑制自由基反應(yīng)過程的任何一種物質(zhì)，均稱為自由基清除劑或抗氧化劑[2]?？寡趸瘎┛梢孕迯?fù)自由基導(dǎo)致的重要生物大分子損傷，適當(dāng)補充外源性抗氧化劑可以平衡體內(nèi)自由基，預(yù)防疾病[3]。因此，人們開始在自然資源中尋找有效的抗氧化劑。蕨類植物有豐富的生物活性成分，如黃酮類、多酚、萜類和生物堿等，黃酮類和多酚廣泛存在于植物的各個部位，具有較強的抗氧化性[4]。

石韋首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為廬山石韋、石韋或有柄石韋的干燥葉，主要化學(xué)成分為多糖、黃酮類、三萜類、揮發(fā)油類和多酚類等，其藥理作用包括利尿通淋、清肺止咳、涼血止血等，臨床主要用于治療腎炎、肺熱喘咳和止血等[5-6]。有柄石韋[Pyrrosia petiolosa （Christ） Ching]，為石韋屬多年生草本植物，其總黃酮和多酚類含量較為豐富，主要活性成分有蘆丁、芒果苷、綠原酸、咖啡酸等，藥用價值較高[7-8]。在水質(zhì)偏硬的地區(qū)，泌尿系統(tǒng)結(jié)石病較為常見，有柄石韋為治療該疾病的常用民族藥，是“結(jié)石通片”和“復(fù)方石韋片”等中成藥的主要原料[9]。有柄石韋以整個干燥葉入藥，包括了葉柄、營養(yǎng)葉、孢子葉、孢子囊等組織部位。目前國內(nèi)外對于石韋的研究主要集中在石韋屬的種質(zhì)差異、化學(xué)成分和藥理活性等方面，但葉片不同組織部位的成分差異及活性等研究尚未見報道[10-13]。本文對有柄石韋葉柄、營養(yǎng)葉、孢子葉、孢子囊和去孢子葉等5個組織部位的有效成分含量和抗氧化活性進行研究，并分析了其相關(guān)性，旨在為石韋藥材的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 植物材料? 有柄石韋采自貴州省安順市（10541 N， 262 E），經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)黃榮韶教授鑒定。

1.1.2? 主要試劑? 植物類黃酮試劑盒（貨號：G0118W 微板法96樣）、植物總酚試劑盒（貨號：G0117W 微板法96樣）、DPPH自由基清除能力試劑盒（貨號：G0128W 微板法96樣）、ABTS自由基清除能力試劑盒（貨號：G0127W 微板法96樣）、總抗氧化能力（FRAP法）試劑盒（貨號：G0115W 微板法96樣）均購自蘇州格銳思生物科技有限公司;綠原酸、咖啡酸、芒果苷、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品均購自北京索萊寶科技有限公司;甲醇、無水乙醇、磷酸等試劑為分析純;甲醇、乙腈為色譜純;水為超純水。

1.1.3? 儀器與設(shè)備? E2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）、1530酶標(biāo)儀（美國賽默飛世爾科技公司）、3K15高速冷凍離心機（德國Sigma公司）、BSA224S-CW電子分析天平（德國Sartorius公司）、KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市金壇友聯(lián)儀器研究所）、Helzbad Hei-VAP旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidolph公司）、7310039離心濃縮凍干機（美國Labconco公司）。

1.2? 方法

1.2.1? 有柄石韋不同部位醇提物和水提物的制備? 提取物制備參考Hee等[14]的方法，將有柄石韋樣品分成5個部位：葉柄、營養(yǎng)葉、孢子葉、孢子囊和去孢子葉（刮去孢子囊的孢子葉）。材料干燥、粉碎，過40目篩，分別稱取2份約2 g粉末，其中一份在室溫下、70%乙醇、料液比為1 ： 20（g/mL）條件下，浸泡48 h提取，得葉柄醇提物（YE）、營養(yǎng)葉醇提物（PE）、孢子葉醇提物（SE）、孢子囊醇提物（FE）和去孢子葉醇提物（QE）;另一份在90 ℃熱水、料液比為1 ： 20條件下，浸泡4 h提取，得葉柄水提物（YH）、營養(yǎng)葉水提物（PH）、孢子葉水提物（SH）、孢子囊水提物（FH）和去孢子葉水提物（QH）。提取液超聲45 min，9000 r/min離心5 min過濾，濾渣加溶劑清洗3次，整合提取液，40 ℃濃縮，離心濃縮凍干機干燥，重復(fù)3次，干樣稱重計算提取率，?20 ℃儲存。

1.2.2? 總黃酮含量的測定? 總黃酮含量采用NaNO2-Al （NO3）3-NaOH顯色法[15]，按照試劑盒說明書方法進行測定。取50 ?L提取液（0.5 mg/mL）于96孔板中，加入15 ?L NaNO2溶液混勻，放置6 min后加入30 ?L Al（NO3）3溶液搖勻，放置6 min后加入105 ?L氫氧化鈉溶液混勻，25 ℃靜置15 min，采用酶標(biāo)儀測定510 nm處吸光值，以空白試劑為參比。使用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）按照前面描述的程序制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=1.0843x ? 0.0158，R2 = 0.9991。結(jié)果以蘆丁當(dāng)量表示（mg/g）。

1.2.3? 總酚含量的測定? 采用福林酚法測定總酚含量[16]，按照試劑盒說明書的方法進行測定。移取10 ?L提取液（0.5 mg/mL）于96孔板中，加入50 ?L Folin-Ciocalteu 試劑混勻，25 ℃避光靜置2 min，加入50 ?L碳酸鈉溶液和90 ?L蒸餾水混勻，室溫下避光30 min，于760 nm處測定吸光值，以空白試劑為參比。使用沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（0、5、10、15、20、25 ?g/mL）按照前面描述的程序制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y = 2.2843x + 0.004，R2 =0.9987。結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量表示（mg/g）。

1.2.4? DPPH自由基清除能力的測定? 按照試劑盒說明書的方法測定DPPH自由基清除能力，DPPH測定液現(xiàn)配現(xiàn)用。于試管中加150 ?L提取液（0.1 mg/mL）和150 ?L DPPH測定液，搖勻后25 ℃避光靜置30 min，12 000 r/min室溫離心5 min，取200 ?L至96孔板中，以無水乙醇為空白對照，使用酶標(biāo)儀在517 nm處測定吸光度，再扣除樣品溶液的吸光值。

式中，A0為空白對照組的吸光值;A1為樣品溶液加測定液的吸光值;A2為樣品溶液的吸光值。

1.2.5? ABTS+自由基清除能力的測定? 按照試劑盒說明書的方法測定ABTS+自由基清除能力，ABTS+測定液現(xiàn)配現(xiàn)用。于96孔板中加入10 ?L提取液（0.5 mg/mL）和190 ?L ABTS+測定液，混勻后于25 ℃避光靜置30 min，以無水乙醇為空白對照，使用酶標(biāo)儀在734 nm處測定吸光值，再扣除樣品溶液的吸光度。

式中，A0為空白對照組的吸光值;A1為樣品溶液加測定液的吸光值;A2為樣品溶液的吸光值。

1.2.6? 總抗氧化能力的測定（FRAP法）? 按照試劑盒說明書的方法測定總抗氧化能力，F(xiàn)RAP顯色液現(xiàn)配現(xiàn)用。在無色96孔板中加入5 μL提取液（2.5 mg/mL），再加入25 μL提取溶劑，最后加入170 μL FRAP顯色液混勻，室溫條件下避光反應(yīng)5 min，使用酶標(biāo)儀在590 nm處測定吸光值。使用Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液（0、0.4、1.2、2.0、2.8、3.6 ?mol/mL）按照前面描述的程序制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y = 0.073x ? 0.0514，R2=0.9909。結(jié)果以等量的水溶性維生素E表示（?mol/mL）。

1.2.7? 有柄石韋不同部位4種有效成分含量的測定? 4種有效成分含量的測定參考《中華人民共和國藥典》[17]，略改進。色譜條件：色譜柱為XBridge C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測波長為300 nm，柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min，乙腈（A）?0.1%磷酸溶液（B）梯度洗脫。洗脫程序：0～5 min，10%～15% A;5～10 min，15%～16% A;10～16 min，16%～19% A;16～21 min，19%～26% A;21～26 min，26%～28% A。

對照品溶液的制備：取綠原酸、芒果苷、咖啡酸和蘆丁對照品，分別用50%甲醇溶解成0.5 mg/mL的對照品溶液，過0.22 μm濾膜，備用。

供試品溶液的制備：5種樣品在50 ℃烘干、粉碎，過40目篩，稱取樣品粉末0.2 g，加50%甲醇25 mL，超聲45 min，過濾，用50%甲醇定容至25 mL，得到葉柄（YM）、營養(yǎng)葉（PM）、孢子葉（SM）、孢子囊（FM）和去孢子葉提取液（QM），過0.22 μm濾膜，備用。

方法學(xué)考察參考賈富娟等[18]并稍作改動。線性關(guān)系：分別取綠原酸、芒果苷、咖啡酸和蘆丁對照品溶液混勻，得5種不同濃度的混合溶液，各取10 μL，注入高效液相色譜儀，平行進樣3次，作線性回歸方程。精密度實驗：取混合對照品溶液重復(fù)進樣6次，每次進樣10 μL，測定各個對照品的峰面積，結(jié)果顯示綠原酸、芒果苷、咖啡酸以及蘆丁峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.92%、1.09%、0.71%、1.67%，表明儀器精密度良好。穩(wěn)定性實驗：取混合對照品溶液，按色譜條件分別在0、2、4、8、16、24 h進樣，最終測得綠原酸、芒果苷、咖啡酸和蘆丁峰面積的RSD分別為2.27%、2.14%、1.07%、1.48%，表明該方法的穩(wěn)定性良好。加樣回收率實驗：精密稱取營養(yǎng)葉樣品3份制得供試品溶液，加入綠原酸、芒果苷、咖啡酸和蘆丁對照品適量，以50%甲醇定容至25 mL。按色譜條件測定，計算加樣回收率，測得綠原酸、芒果苷、咖啡酸和蘆丁峰的回收率分別為101.20%，100.74%、99.52%、98.03%;RSD分別為1.24%、1.48%、0.92%、2.15%。

按照色譜條件測定供試品溶液中4種指標(biāo)成分的含量。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

每組實驗均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)平均值之間的差異通過單向方差分析（ANOVA）和鄧肯多重比較檢驗進行評估，相關(guān)性分析采用Pearson法進行組分與活性的關(guān)聯(lián)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 有柄石韋不同部位的提取率

有柄石韋不同部位的提取率大小不同。由表1可以看出，去孢子葉水提物和醇提物的提取率最高，顯著高于其他部位;其次是孢子葉，SH和SE顯著高于PH和PE，孢子囊的提取率最低，F(xiàn)E和FH之間差異不顯著。有柄石韋中不同部位的醇提取率和水提取率大小排列相同，均為去孢子葉>孢子葉>營養(yǎng)葉>葉柄>孢子囊。

2.2? 有柄石韋不同部位總黃酮和總酚含量

由表1可知，有柄石韋不同部位的總黃酮和總酚含量差異較大。總黃酮含量較高的是QH、PH、SH和QE，顯著高于其他提取液樣品，F(xiàn)H的總黃酮含量最低，約為QH的1/5?？偡雍孔罡叩氖荙E和QH，與PH的差異未達到顯著性水平，但顯著高于其他提取物;其次是PE、PH、SE、和SH，均顯著高于YE和YH;FE和FH的總酚含量最低，約為QE的1/3。

2.3? 有柄石韋不同部位DPPH自由基清除能力

有柄石韋不同部位有不同程度的清除 DPPH 自由基的能力。如圖1所示，在不同部位的醇提物中PE和QE的DPPH自由基清除率較高，均高于88%，顯著高于SE、YE和FE;各部位水提物中PH的清除率最大，為85.86%，其次是QH和SH，顯著高于YH和FH，F(xiàn)H的清除率最低。

2.4? 有柄石韋不同部位ABTS+自由基清除能力

由圖2可知，在醇提物中，PE的清除率最高，為69.44%，顯著高于SE、YE和FE，YE和FE的差異不顯著。在水提物中，分析結(jié)果與醇提物一致，F(xiàn)H對ABTS+自由基的清除率最低，僅為47.37%;不同部位提取物對ABTS+自由基能力強弱與DPPH分析結(jié)果高度相似。

2.5? 有柄石韋不同部位總抗氧化能力（FRAP法）

總抗氧化能力的測定結(jié)果見圖3，有柄石韋不同部位提取物總抗氧化能力強弱不同。在不同部位的醇提物中，總抗氧化能力最高的是PE，為（3.12±0.15）?mol/mL，與QE差異不顯著，但顯著高于SE、YE和FE;在水提物中，最高的是PH，為（2.58±0.06）?mol/mL，各部位之間的總抗氧化能力的差異均達到顯著性水平，強弱排序為：PH>QH>SH>YH>FH。

2.6? 有柄石韋不同部位4種有效成分的含量

綠原酸、芒果苷、咖啡酸和蘆丁的線性回歸方程見表2，測定結(jié)果如表3和圖4所示，4種有效成分在有柄石韋營養(yǎng)葉、孢子葉和去孢子葉中都有被檢測到。去孢子葉和營養(yǎng)葉的綠原酸含量含量分別為（7.37±1.22）、（6.94±0.23）mg/g，顯著高于孢子葉、葉柄和孢子囊;咖啡酸在葉柄和孢子囊中未檢測到，營養(yǎng)葉中的咖啡酸含量高于去孢子葉和孢子葉，孢子葉中的咖啡酸含量僅為營養(yǎng)葉的1/5;蘆丁在孢子囊中未檢出，營養(yǎng)葉和去孢子葉的蘆丁含量相近，是葉柄含量的3倍。

2.7? 有柄石韋不同部位有效成分與抗氧化活性的相關(guān)性分析

總黃酮和酚類化合物對抗氧化活性有很大影響。如表4所示，分析有柄石韋不同部位的4種成分和抗氧化活性的每個參數(shù)之間都顯示出良好的相關(guān)性，TF、TP、綠原酸、芒果苷、咖啡酸以及蘆丁的含量都與DPPH和ABTS+自由基清除活性呈極顯著相關(guān)（P<0.01），與總抗氧化能力顯著相關(guān)（P<0.05）。

3? 討論

本研究結(jié)果表明，有柄石韋不同部位的提取成分含量不同，提取率在11.56%～25.36%之間。不同部位的醇提取率和水提取率大小排序相同，均為：去孢子葉>孢子葉>營養(yǎng)葉>葉柄>孢子囊。有柄石韋各部位均含有總黃酮和總酚，總黃酮含量在27.33～ 129.46 mg/g之間，Cao等[19]的研究中有柄石韋總黃酮含量（80.6 mg/g）僅次于肉質(zhì)伏石蕨（125.9 mg/g）;總酚含量在11.49～47.85 mg/g之間，表明有柄石韋中的總黃酮和總酚物質(zhì)含量豐富。種貝貝[20]研究中有柄石韋醇提總黃酮含量是水提物的5.61倍，本研究與之不同的是去孢子葉、營養(yǎng)葉和孢子葉的水提物中的總黃酮含量高于醇提物，葉柄和孢子囊水提物的總黃酮含量則低于醇提物。有柄石韋去孢子葉、營養(yǎng)葉和孢子葉的水提物以及去孢子葉的醇提物中的總黃酮含量較高，總酚含量較高的是去孢子葉的醇提物和水提物以及營養(yǎng)葉的水提物，總黃酮和總酚含量最低的是孢子囊的醇提物和水提物。而營養(yǎng)葉和孢子葉提取物的總黃酮和總酚含量差異均未達到顯著性水平，孢子葉的提取率卻大于營養(yǎng)葉，可能是孢子葉提取物中含有其他成分，陳超君等[21]研究發(fā)現(xiàn)石韋屬的石韋植物中孢子葉的總皂苷含量高于營養(yǎng)葉。

在抗氧化活性測定試驗中，營養(yǎng)葉的抗氧化效果最好，營養(yǎng)葉水提物的自由基清除效果和總抗氧化能力均顯著高于其他部位的水提物，營養(yǎng)葉醇提物的抗氧化活性也顯著高于孢子葉、葉柄和孢子囊。唐雅楠等[22]研究發(fā)現(xiàn)75%乙醇洗脫獲得的樣品中的抗氧化活性比水強。本研究中有柄石韋各部位醇提物的抗氧化能力普遍強于水提物，說明有柄石韋中抗氧化物質(zhì)種類復(fù)雜，70%乙醇提取的物質(zhì)抗氧化活性較強。這可能是醇提物中抗氧化物質(zhì)會在一定的抗氧化體系中產(chǎn)生協(xié)同作用，使得其抗氧化活性更高[23]。

石韋屬植物含有多種植物化學(xué)物質(zhì)，有柄石韋中常見綠原酸、芒果苷、咖啡酸和蘆丁等有效成分[24]。本研究中，綠原酸、芒果苷和蘆丁在去孢子葉和營養(yǎng)葉的含量明顯較高，石韋藥材中的綠原酸作為藥典[19]指定指標(biāo)成分，去孢子葉和營養(yǎng)葉的綠原酸含量高達7 mg/g，孢子囊最少，僅為1.76 mg/g，營養(yǎng)葉的綠原酸含量比孢子葉高1.93 mg/g;而咖啡酸在葉柄和孢子囊中未檢測到，營養(yǎng)葉的咖啡酸含量高于去孢子葉和孢子葉，孢子葉的咖啡酸含量僅為營養(yǎng)葉的1/5;營養(yǎng)葉的蘆丁含量比孢子葉高6.25 mg/g，是葉柄的3倍。

有柄石韋不同部位的總黃酮、總酚含量與抗氧化活性呈顯著正相關(guān)，與莊遠杯等[25]的研究結(jié)果相同，說明總酚和黃酮類物質(zhì)是其具有抗氧化活性的主要作用成分。綠原酸、芒果苷、咖啡酸、蘆丁也與DPPH、ABTS+自由基清除能力及總抗氧化能力呈顯著正相關(guān)，4種指標(biāo)物質(zhì)在其抗氧化活性中發(fā)揮了重要作用。

綜上可知，有柄石韋去孢子葉和營養(yǎng)葉的總黃酮和總酚以及4種指標(biāo)物質(zhì)的含量較孢子葉、葉柄和孢子囊高，營養(yǎng)葉的抗氧化能力強于其他4個部位，且有柄石韋不同部位清除ABTS+自由基清除能力、DPPH自由基清除能力及總抗氧化能力均與其有效成分含量呈顯著正相關(guān)（P< 0.05）。有柄石韋的孢子囊和葉柄的有效成分含量較低，相對孢子葉，營養(yǎng)葉具有較多的有效成分和更強的抗氧化能力，質(zhì)量更佳。此外，關(guān)于石韋植物葉片不同組織部位的成分差異及活性等研究極少，今后可對其進行深入考察，以期為石韋藥材的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

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責(zé)任編輯：崔麗虹