汪文婧，程儲(chǔ)記，陳旭昕，韓志海

[關(guān)鍵字]肺泡上皮細(xì)胞；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；內(nèi)毒素；急性呼吸窘迫綜合癥；氧化應(yīng)激

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)/急性呼吸窘迫綜合癥(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是由肺內(nèi)外多種損傷因素引起的臨床危重癥，目前尚缺乏特異性有效治療手段[1]。大量的實(shí)驗(yàn)研究表明氧化應(yīng)激與ALI/ARDS密切相關(guān)[2-4]，根據(jù)ARDS患者多項(xiàng)臨床試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺泡上皮細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下，不斷暴露于氣態(tài)氧和有毒物質(zhì)，清除過量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）及使用抗氧化劑并不能改善ARDS患者預(yù)后[5]，那抑制氧化應(yīng)激的發(fā)生是否是治療ARDS的一個(gè)思路？有研究涉及相關(guān)領(lǐng)域，如El-Agamy[6]的研究表明，抑制及減少炎癥因子及氧自由基的表達(dá)，可遏制ALI/ARDS的發(fā)生及發(fā)展；Ye等[7]在急性胰腺炎-急性肺損傷（AP-ALI）研究中也發(fā)現(xiàn)，減少ROS重要氧化劑的產(chǎn)生對(duì)AP-ALI有保護(hù)作用；Meng等[8]表示黃芩苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI的保護(hù)作用主要是維持了氧化和抗氧化應(yīng)激的平衡。結(jié)合相關(guān)理論知識(shí)，本研究大膽的推測(cè)抑制肺泡上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)下ROS的產(chǎn)生可以成為治療ALI/ARDS的新策略。為了驗(yàn)證這一想法，本研究選取了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC）作為治療手段。

BMSC[9-10]因其具有高度的自我更新能力和多向分化潛能，取材方便、易于分離培養(yǎng)、免疫原性低等特點(diǎn)，直接使用由骨髓分離擴(kuò)增的間質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行移植時(shí)，無免疫排斥的問題，因此成為目前較理想的基因工程種子細(xì)胞的來源，具有良好的臨床應(yīng)用前景。近年已有研究者[11]將BMSC引入到肺損傷等肺部疾病的治療中，BMSC在適當(dāng)條件下可定向分化為肺泡上皮細(xì)胞（alveolar epithelial cell,AEC）和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞（pulmonary vascular endothelial cell,PVEC）等多種非造血組織細(xì)胞,多項(xiàng)研究[12-13]提示BMSC在內(nèi)毒素（lipopolysaccharide,LPS）所致的急性肺損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用，并且我們的前期研究[14]中也已經(jīng)從細(xì)胞周期阻滯角度明確了BMSC對(duì)PVEC的保護(hù)作用。

由于Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞（alveolar epithelial cellⅡ,AECⅡ）的體外培養(yǎng)難度較大，無法保證充足來源，本研究最終選擇利用A549細(xì)胞代替AECⅡ，A549細(xì)胞[15]來源于肺腺癌患者的肺泡基底上皮細(xì)胞，保持了典型的AECⅡ的重要特征，由D.J.Giard[16]于1972年從肺腺癌患者的組織中首次分離培養(yǎng)得到，A549細(xì)胞株作為AECⅡ的體外模型，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于ARDS和肺泡上皮細(xì)胞相關(guān)研究[17-18]。本研究利用Transwell共培養(yǎng)體系，在體外通過LPS干預(yù)培養(yǎng)AECⅡ，模擬ALI時(shí)的炎癥微環(huán)境，從氧化失衡角度觀察BMSC對(duì)AECⅡ的影響，以期為BMSC在ALI/ARDS治療中的應(yīng)用提供更多實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑人源性A549細(xì)胞來源于美國(guó)ATCC公司；人源性BMSC細(xì)胞由廣州賽業(yè)生物科技有限公司提供，且已完成干細(xì)胞免疫表型及多能分化潛能鑒定；本實(shí)驗(yàn)室對(duì)這些細(xì)胞分別進(jìn)行傳代及繼續(xù)培養(yǎng)。DMEM/F12培養(yǎng)基和優(yōu)質(zhì)胎牛血清（FBS）購(gòu)于GIBCO公司，Transwell系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)corning公司，LPS（Ecoil O55：B5）、細(xì)胞衰老檢測(cè)試劑盒KGPAG001L購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽過氧化 物 酶（glutathione peroxidase,GSH）、丙 二 醛（malondialdehyde,MDA）及脂過氧化物（lipid peroxides,LPO）試劑盒購(gòu)于南京建成公司；CCK-8試劑盒、活性氧(reactive oxygen species，ROS）試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)BMSC及A549細(xì)胞培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基，由DMEM/F12培養(yǎng)基、FBS及雙抗（青霉素、鏈霉素）配置而成，于4℃保存，現(xiàn)用現(xiàn)配，保存期30 d。細(xì)胞培養(yǎng)條件均為：37℃、5%CO2及95%濕度，每隔1 d換液1次，2～3 d傳代1次，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.3 Transwell共培養(yǎng)體系為了滿足實(shí)驗(yàn)共培養(yǎng)的需要，選取0.4 μm孔徑、6 well的聚碳酯膜Transwell共培養(yǎng)體系，將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上室內(nèi)盛裝上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)盛裝下層培養(yǎng)液，將BMSC細(xì)胞接種于上室，下室接種A549細(xì)胞。

1.4 預(yù)實(shí)驗(yàn)：A549細(xì)胞活性及通透性檢測(cè)①將A549細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板上，完全培養(yǎng)基于37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，用0、10、20、40、80、100、150和200 μg/mL LPS干預(yù)培養(yǎng)12 h后，使用CCK-8試劑盒進(jìn)行細(xì)胞活性測(cè)定。根據(jù)試劑說明書，每培養(yǎng)孔中加入CCK-8溶液10 μL，37℃孵育2 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的OD值。②將A549細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板上，完全培養(yǎng)基于37℃的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，用100 μg/mL LPS干預(yù)培養(yǎng)0、2、4、6、12、24 h后，使用CCK-8試劑盒測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的A549細(xì)胞活性，使用細(xì)胞衰老檢測(cè)試劑盒KGPAG001L檢測(cè)A549細(xì)胞的衰老程度及通透性。

1.5 BMSC與A549細(xì)胞共培養(yǎng)以A549細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，單獨(dú)培養(yǎng)或利用Transwell共培養(yǎng)體系讓1×104的BMSC與2×103的A549細(xì)胞共培養(yǎng)，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，培養(yǎng)過夜后使用100 ng/mL LPS或等體積的PBS進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)6 h；具體分組及操作如下：①A549組（A549單獨(dú)培養(yǎng)，PBS干預(yù)）；②A549+LPS組（A549單獨(dú)培養(yǎng)，LPS干預(yù)）；③A549-BMSC+LPS組（A549與BMSC共培養(yǎng)，LPS干預(yù)）；④A549-BMSC+PBS組（A549與BMSC共培養(yǎng)，PBS干預(yù)）。

1.6 ROS水平檢測(cè)根據(jù)活性氧檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行，收集各組的A549細(xì)胞樣本，懸浮于稀釋好的活性氧檢測(cè)試劑盒中的DCFH-DA無血清培養(yǎng)液中，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為106/mL，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min后洗滌細(xì)胞樣本，最后用流式細(xì)胞儀（Ex=488 nm；Em=530 nm）進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)ROS的熒光強(qiáng)弱判斷A549細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)高低。

1.7 LPO、MDA、SOD、GSH水平檢測(cè)參照檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，收集各組A549細(xì)胞樣本于離心管中，用完全培養(yǎng)基混勻獲得細(xì)胞懸浮液；按各試劑盒說明書進(jìn)行對(duì)應(yīng)操作后測(cè)得各組OD值，根據(jù)OD值計(jì)算各組LPO、MDA、SOD、GSH水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A549細(xì)胞活性及通透性A549細(xì)胞在10～40

μg/mL LPS干預(yù)12 h后，細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)，且呈劑量依賴性(P＜0.05)；當(dāng)LPS濃度≥100 μg/mL時(shí)，A549細(xì)胞存活率顯著降低(P＜0.05)；其中，150 μg/mL LPS對(duì)A549細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性，使細(xì)胞活性下降到約44%（表1）。LPS可誘導(dǎo)A549細(xì)胞的衰老，降低細(xì)胞活性，并以時(shí)間依賴性的方式增加細(xì)胞的通透性；LPS刺激后第6、12和24 h，A549細(xì)胞的衰老程度及通透性均有顯著性差異（表2）。因此，本研究選擇能顯著降低細(xì)胞活性、增加細(xì)胞通透性的合適劑量（100 μg/mL）及最短LPS暴露時(shí)間（6 h）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 不同濃度LPS干預(yù)培養(yǎng)時(shí)A549的細(xì)胞活性

表2 100 μg/mL LPS干預(yù)培養(yǎng)不同時(shí)長(zhǎng)時(shí)A549的細(xì)胞活性及通透性

2.2 A549細(xì)胞內(nèi)ROS水平結(jié)果顯示，與A549對(duì)照組比較，A549+LPS組細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)水平明顯升高（P＜0.001）；與A549+LPS組比較，A549-BMSC+LPS組細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)水平明顯降低（P=0.001）；A549-BMSC+PBS組與A549對(duì)照組比較，其ROS表達(dá)水平是減低的（P=0.033）；圖1、表3。

圖1 A549細(xì)胞內(nèi)ROS的流式細(xì)胞儀檢測(cè)

表3 A549細(xì)胞內(nèi)ROS水平

2.3 A549細(xì)胞內(nèi)氧化因子LPO、MDA的表達(dá)水平

結(jié)果顯示，與A549組比較，A549+LPS組LPO、MDA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.001）；與A549+LPS組比較，A549-BMSC+LPS組LPO、MDA表達(dá)水平明顯降低（P=0.006、P＜0.001）；A549-BMSC+PBS組與A549對(duì)照組比較，其LPO、MDA表達(dá)水平是減低的（P=0.012，表4）。

表4 各組A549細(xì)胞中LPO、MDA水平

2.4 A549細(xì)胞內(nèi)的抗氧化因子SOD、GSH活性檢測(cè)結(jié)果顯示，與A549對(duì)照組比較，A549+LPS組SOD、GSH的活性明顯降低（P＜0.001）；與A549+LPS組比較，A549-BMSC+LPS組SOD、GSH的活性明顯升高（P=0.001、P=0.028）；與A549對(duì)照組相比，A549-BMSC+PBS組SOD、GSH的活性呈升高趨勢(shì)（P=0.001、P=0.002,表5）。

表5 各組A549細(xì)胞中SOD、GSH活性

3 討論

ARDS在病理學(xué)上表現(xiàn)為失控的炎癥反應(yīng)引起彌漫性肺泡上皮的損傷[19]，并且AECⅡ主動(dòng)參與了ARDS的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸，在ARDS發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著十分重要的作用[20-22]，本實(shí)驗(yàn)利用AECⅡ模擬肺的微環(huán)境，通過LPS誘導(dǎo)在體外創(chuàng)建了ARDS的細(xì)胞模型，首次試圖從氧化應(yīng)激角度探究BMSC對(duì)AECⅡ的保護(hù)作用，擬為臨床工作提供相關(guān)思路。

氧化應(yīng)激是由于體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和抗氧化能力的不平衡而引起的[23]，其中ROS是評(píng)估氧化應(yīng)激的一個(gè)重要指標(biāo)，是需氧細(xì)胞在代謝過程中產(chǎn)生的活性氧簇，主要包括O2-、H2O2、·OH等，是氧的自由基狀態(tài)，具有較高的活性[24]。ROS可以攻擊生物膜和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中不飽和脂肪酸，使膜脂過氧化，導(dǎo)致生物膜的結(jié)構(gòu)和功能損傷，大量的ROS還會(huì)損傷線粒體及DNA，當(dāng)損傷DNA發(fā)生難以修復(fù)的斷裂時(shí)，將影響基因水平的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，嚴(yán)重者可以導(dǎo)致細(xì)胞的死亡[25]。ROS代謝過程中產(chǎn)生的MDA、LPO產(chǎn)物，是氧化應(yīng)激的指示劑，可反映膜脂過氧化的程度及膜系統(tǒng)受損程度[26-27]。本研究也再次論證了在LPS刺激下，A549細(xì)胞內(nèi)ROS的水平明顯升高，ROS代謝產(chǎn)物MDA、LPO含量也顯著增高，表明LPS所致的A549細(xì)胞損傷使其發(fā)生了強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

此次研究中利用MDA、LPO、SOD、GSH評(píng)價(jià)ROS的產(chǎn)生及清除狀態(tài)，MDA、LPO含量是反映體內(nèi)氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化水平的客觀指標(biāo)，而SOD、GSH活性則是反映機(jī)體清除氧自由基能力的客觀指標(biāo)。SOD、GSH-PX是抗氧化系統(tǒng)的抗氧化酶，是重要的抗氧化劑和自由基清除劑，能起到強(qiáng)有力的保護(hù)作用，也是清除ROS過程中的最重要的酶，其高低活性標(biāo)志著ROS的清除狀態(tài)及機(jī)體的抗氧化水平[28-29]。

本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在A549+LPS組中，LPS誘導(dǎo)后A549細(xì)胞內(nèi)ROS的水平、MDA、LPO含量均明顯升高，而SOD、GSH-PX的活性表現(xiàn)出明顯的降低，提示LPS刺激A549發(fā)生了強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激，并明顯削弱了A549細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力。在A549-BMSC+LPS組 中，LPS誘 導(dǎo) 后A549細(xì) 胞 內(nèi)ROS的水平、MDA、LPO含量較A549對(duì)照組明顯升高，SOD、GSH-PX的活性較A549對(duì)照組有所降低，而對(duì)比A549+LPS組可以發(fā)現(xiàn)A549-BMSC+LPS組中ROS的水平、MDA、LPO含量升高是明顯減少的，SOD、GSH-PX的活性的降低也是明顯減少的，提示在A549與BMSC共培養(yǎng)后，LPS刺激的A549產(chǎn)生的ROS及其代謝產(chǎn)物MDA、LPO明顯減少，說明BMSC有所抑制ROS的產(chǎn)生，并且同時(shí)增強(qiáng)了A549細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力，提高了SOD、GSHPX的活性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，將A549-BMSC+PBS組實(shí)驗(yàn)結(jié)果與A549對(duì)照組進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)A549-BMSC+PBS組ROS的水平、MDA及LPO含量較A549對(duì)照組表現(xiàn)下降趨勢(shì)，而SOD、GSH-PX的活性表現(xiàn)出明顯上升趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示BMSC對(duì)A549細(xì)胞就從氧化應(yīng)激角度來說存在保護(hù)作用，能正向調(diào)節(jié)其抗氧化的能力，減弱氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而在LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)可以一定程度上控制氧化與抗氧化的失衡。

本研究?jī)H僅通過氧化及抗氧化因子，從氧化應(yīng)激角度明確了BMSC對(duì)AECⅡ細(xì)胞的保護(hù)作用，存在一定的局限性，因ROS與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，是炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)因素[30]，大量的研究證實(shí)，ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激作為ALI/ARDS發(fā)病機(jī)制的參與者，可以刺激絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）、核苷結(jié)合域樣受體蛋白3(NLRP3)炎性小體、NF-κB等多種炎性信號(hào)通路，引起細(xì)胞損傷[4,31-33]。而炎癥細(xì)胞也可誘導(dǎo)ROS的過度生成，炎癥因子如IL-6、TNF-α的爆發(fā)可激活中性粒細(xì)胞，引起一氧化氮合酶表達(dá)增加，導(dǎo)致生成大量一氧化氮，一氧化二氮和超氧自由基發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生ROS和過氧亞硝酸鹽而發(fā)生細(xì)胞毒性作用，過度活化核修復(fù)酶PARP，導(dǎo)致ATP耗盡和細(xì)胞損傷，從而加速ALI/ARDS的發(fā)生及發(fā)展[34-36]。那BMSC對(duì)AECⅡ細(xì)胞的保護(hù)作用是否與抑制炎癥反應(yīng)相關(guān)？并且BMSC抑制ROS生成、減輕氧化應(yīng)激的分子機(jī)制是什么？與MAPK、NLRP3炎性小體、NF-κB等多種炎性信號(hào)通路是否存在必然聯(lián)系？這將是我們下一步的研究重點(diǎn)。

綜上所述，本研究目前的研究明確BMSC能顯著減輕LPS誘導(dǎo)的AECⅡ細(xì)胞的ROS生成，同時(shí)能正向調(diào)節(jié)其抗氧化的能力，可以一定程度上抑制LPS誘導(dǎo)的AECⅡ細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)。由此我們認(rèn)為抑制肺泡上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)下ROS的產(chǎn)生、增強(qiáng)肺泡上皮細(xì)胞抗氧化的能力，或許可以成為治療ALI/ARDS的新策略之一。