黃大祥，李夢媛，秦嶺，彭艾

高血磷是慢性腎臟病(chronic kidney diseases,CKD)患者常見的電解質(zhì)紊亂，50%以上的透析患者合并血磷升高，被稱為沉默殺手[1]。無論是對于CKD 3～4期的患者、透析患者或腎功能正常者，血磷均與血管鈣化和心血管疾?。╟ardiovascular diseases,CVD）死亡率呈正相關(guān)[2-4]。因此，高血磷是CKD患者CVD高發(fā)病率和高死亡率的高危因素。

內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和凋亡是CVD的早期事件和始動環(huán)節(jié)。臨床研究表明，正常人即使短期攝入高磷飲食，也能損害內(nèi)皮細(xì)胞功能，影響血管舒張[5]；高血壓人群即使血磷在正常水平，血磷濃度依然和內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙呈正相關(guān)[6]。但高血磷造成內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和功能障礙的具體分子機(jī)制尚未明確。前期的研究中，代謝組學(xué)被用來揭示不同磷濃度下內(nèi)皮細(xì)胞氨基酸譜的差異表達(dá)[7]。研究發(fā)現(xiàn)高磷能在體外誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，并推測其可能的機(jī)制是通過調(diào)節(jié)MAPK通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[8]。然而，其上下游調(diào)控蛋白尚不清楚。本研究用體外高磷培養(yǎng)液刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，檢測Ras同源物基因家族成員A（Ras homolog gene family,member A,RhoA）/Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶1/2(Rhoassociated coiled coil forming protein kinase 1/2,ROCK1/2)/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，評估ARG的活性和細(xì)胞的凋亡情況，并進(jìn)一步通過RhoA抑制劑SV抑制RhoA/ROCK通路，明確RhoA/ROCK/MAPK通路在高磷誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用。本研究為進(jìn)一步闡明高磷環(huán)境內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器兔抗人細(xì)胞外信號調(diào)控激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK），磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)控激酶（phosphorylated-extracellular signal-regulated kinase,p-ERK），p38，磷酸化p38（phosphorylated p38,p-p38），精氨酸酶1（arginase1，ARG1），一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）抗體，鼠抗人β-肌動蛋白（β-actin）抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(美國Cell Signaling Technology公司)；內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液（美國Lonza Walkersville公司），RhoA抑制劑辛伐他?。╯imvastatin,SV）標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司)；BCA蛋白濃度檢測試劑盒（上海碧云天公司）；奧德賽凝膠成像系統(tǒng)（美國LI-COR公司）。電泳儀，電泳槽，比色儀，細(xì)胞凋亡檢測試劑盒及流式細(xì)胞儀均購自美國BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理HUVEC(中國科學(xué)院細(xì)胞庫)在標(biāo)準(zhǔn)條件下用培養(yǎng)液傳代，細(xì)胞按處理條件分為正常磷組（1.0 mmol/L），高磷組（3.0 mmol/L），正常磷+SV（1.0 mmol/L+SV）,高磷+SV(3.0 mmol/L+SV）培養(yǎng)24 h，SV在培養(yǎng)液中的濃度為100 μg/mL。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 Western印跡法收取各組HUVEC，提取總蛋白，檢測蛋白濃度（BCA法），SDS PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%牛血清白蛋白37℃封閉，2 h后分別加入一抗ERK(1:1 000)、p-ERK(1:800)、p38MAPK(1:1 000)、p-p38MAPK(1：800)、ARG1(1:500)、NOS(1:800)、β-actin(1:2 000)4℃孵育過夜；5%牛血清白蛋白稀釋二抗(兔抗1：3 000，鼠抗1：3 000)，室溫孵育，1 h后洗膜。掃描采用奧德賽凝膠成像系統(tǒng)，βactin為內(nèi)參，灰度分析使用Image J軟件。

1.3.2 ARG活性測定通過比色測定法測定HUVEC的ARG活性。將75 μL，10 mM MnCl2(pH7.5)添加到細(xì)胞勻漿中，加熱至56℃、10 min，加入50 μL L-精氨酸（pH 9.7），37℃孵育60 min，終止液結(jié)束反應(yīng)。加入25 μLα-異亞硝基苯乙酮，100℃孵育60 min。然后將混合物加載到離心過濾器上，并在室溫下以5 000×g離心5 min，分光光度計中540 nm下測定濾液中尿素的濃度，根據(jù)尿素生成速度表示ARG活性。

1.3.3 AnnexinV-FITC/PI染色法檢測細(xì)胞凋亡收集各組HUVEC，室溫下離心（1 000 r/min離心5 min），4℃PBS洗滌細(xì)胞2次，將5 μL AnnexinVFITC暗處混勻，室溫孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用GraphPad Prism7.0軟件統(tǒng)計和繪圖。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；組間均數(shù)差異比較采用t檢驗，多組間均數(shù)差異比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western評估蛋白表達(dá)情況高磷RhoA和ROCK1/2的表達(dá)較正常磷增加，圖1。

圖1 不同磷濃度組的RhoA和ROCK1/2的表達(dá)情況

高磷能激活ERK MAPK的表達(dá)（正常磷組比高磷組t=20.78,P＜0.0001），SV抑制高磷組ERK MAPK的磷酸化（高磷組比高磷+SV組,t=7.746，P=0.0015），圖2A；高磷能抑制p38 MAPK的表達(dá)（正常 磷 組比 高磷 組，t=20.7，P＜0.0001），而對p38 MAPK的 磷 酸 化 無 影 響P＞0.05，圖2B；高 磷 組ARG1的表達(dá)高于正常磷組（正常磷組比高磷組,t=10.78,P=0.0004），圖2C；NOS的表達(dá)低于正常磷組（正常磷組比高磷組,t=28.32,P＜0.0001），圖2D；SV能抑制ARG1和增強(qiáng)NOS的表達(dá)（高磷組比高磷+SV組,t=7.071,P=0.0021，圖2C；高磷組比高磷+SV組，t=7.762,P=0.0002，圖2D）。

圖2 A各組細(xì)胞ERK MAPK、p38 MAPK、ARG1及NOS蛋白表達(dá)情況

2.2 ARG活性評估和正常磷組ARG活性比較，高磷組ARG活性明顯升高（正常磷組比高磷組,t=10.58,P=0.0005），而SV可以抑制高磷組ARG活性（高磷組比高磷+SV組，t=6.501，P=0.0029），圖3。

圖3 各組HUVEC的ARG活性比較

2.3 細(xì)胞凋亡評估高磷組HUVEC的細(xì)胞凋亡明顯高于正常磷組（正常磷組比高磷組0.8%比9.0%,P＜0.001)；SV降低高磷HUVEC的凋亡(高磷組比高磷+SV組9.0%比3.8%,P=0.015)，圖4。

圖4 AnnexinV-FITC/PI雙染法評估各組HUVEC凋亡情況

3 討論

高血磷是CKD常見的代謝異常，也是CKD患者發(fā)生CVD的獨(dú)立危險因素[1]。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和凋亡是CVD的早期事件和始動環(huán)節(jié)；但高磷如何導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和凋亡的機(jī)制尚不明確。有研究提出：高磷促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，增加ROS產(chǎn)生，阻斷線粒體膜電位，活化caspase誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。前期的研究證實(shí)：高磷可能通過激活MAPK通路調(diào)節(jié)HUVEC凋亡，但其具體調(diào)控通路并未進(jìn)一步深入研究。

ARG能將精氨酸水解成鳥氨酸和尿素，參與鳥氨酸循環(huán)。ARG和NOS同時以精氨酸為底物，ARG活性增加可能競爭性抑制NOS合成，減少NO的生成,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和凋亡；抑制ARG活性可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生NO，改善內(nèi)皮細(xì)胞功能，減少細(xì)胞凋亡[10]。目前，ARG已經(jīng)成為治療多種心血管疾病的新靶點(diǎn)[11]。本研究小組曾經(jīng)報道高磷環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞鳥氨酸，瓜氨酸的表達(dá)增加而精氨酸表達(dá)減少。本研究推測高磷可能通過提高ARG的活性增加精氨酸的降解，降低精氨酸含量。本研究也發(fā)現(xiàn)：高磷環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞的ARG活性以及ARG1的蛋白表達(dá)均增加，證實(shí)了上述推測。

RhoA/ROCK途徑可以調(diào)節(jié)ARG活性，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能[12]。在血管平滑肌細(xì)胞，高磷能激活ROCK通路，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的鈣化和凋亡[13]；RhoA作為p-38 MAPK，ERK-MAPK的調(diào)控蛋白，可以調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的分化[14]；然而，在高磷環(huán)境內(nèi)皮細(xì)胞RhoA/ROCK/MAPK信號的激活情況尚無報道。本研究發(fā)現(xiàn)，高磷環(huán)境下HUVECs的RhoA、ROCK1/2蛋白及下游p-ERK的表達(dá)增加，RhoA抑制劑SV可抑制p-ERK蛋白的表達(dá)；盡管高磷組pp38的表達(dá)低于正常磷，但RhoA抑制劑SV并未改變其表達(dá)。因此，本研究認(rèn)為，雖然都是通過MAPK通路進(jìn)行調(diào)控，但和平滑肌細(xì)胞的調(diào)控通路不同，高磷環(huán)境下RhoA/ROCK是通過調(diào)節(jié)ERK MAPK通路來調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能的。另外，本研究中高磷組ARG1的表達(dá)升高，ARG活性增加，eNOS的表達(dá)減少，提示：高磷條件下HUVEC可通過RhoA/ROCK途徑激活p-ERK MAPK的表達(dá)，調(diào)節(jié)ARG活性，抑制NOS活性，引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和功能障礙。曾有研究報道：血管緊張素II可以通過RhoA/ROCK/p-38 MAPK途徑提高ARG活性，從而導(dǎo)致NO合成減少和內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[15]。此外高鹽也可以激活ROCK，通過調(diào)節(jié)不對稱二甲基精氨酸導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[16]。這些研究結(jié)果和本研究結(jié)果一致，都證實(shí)了RhoA/ROCK/MAPK通路參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙。

SV是臨床上廣泛應(yīng)用的調(diào)脂藥物。有研究證實(shí)：SV可以改善高糖和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)：SV作為RhoA的抑制劑，可能會通過抑制RhoA/ROCK/MAPK通路而改善高磷誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，這一發(fā)現(xiàn)提示SV用于合并高血磷的CKD患者，可能有獨(dú)立于調(diào)脂作用的臨床獲益。當(dāng)然，需要前瞻性的臨床研究來進(jìn)一步明確上述可能性。

綜上所述，本研究驗證了高磷誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的重要代謝途徑。首次發(fā)現(xiàn)高磷條件下，HUVEC的RhoA/ROCK/ERK MAPK通路能通過調(diào)節(jié)ARG活性抑制NOS活性，引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；SV可以通過抑制RhoA/ROCK/ERK-MAPK通路，改善內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。這項研究將為闡明高磷誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制奠定堅實(shí)的理論和實(shí)驗基礎(chǔ)，為研究和開發(fā)干預(yù)CKD患者高磷相關(guān)心血管疾病的新藥提供新的潛在靶點(diǎn)。