劉明珠，李夢(mèng)夢(mèng)，黃帥帥，余 慶，徐鳳巧,4，李鵬飛,**

(1.廣西壯族自治區(qū)漁業(yè)重大疫病防控與高效健康養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)技術(shù)工程研究中心，廣西南寧 530007；2.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007；3.北部灣大學(xué)海洋學(xué)院，廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西欽州 535011；4.廣西科學(xué)院，廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530007)

0 引言

卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)具有肉質(zhì)鮮美、生長(zhǎng)迅速等優(yōu)點(diǎn)，主要分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)，在我國(guó)主要分布在粵、瓊、閩等省的沿海城市，是一種重要的經(jīng)濟(jì)型養(yǎng)殖魚類[1-4]。近年來由于過渡捕撈導(dǎo)致自然水體魚類減少，為解決日益增長(zhǎng)的需求量，養(yǎng)殖人員通過各種方式進(jìn)行大規(guī)模飼養(yǎng)，其中以集約化網(wǎng)箱養(yǎng)殖最為流行。集約化網(wǎng)箱養(yǎng)殖具有產(chǎn)量高、養(yǎng)殖時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)，但這種養(yǎng)殖方式易引發(fā)各種病害，對(duì)卵形鯧鲹養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成了極大影響[5-9]。

溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)是一種嗜鹽、嗜溫菌，廣泛分布在熱帶及亞熱帶沿海地區(qū)[10-11]。溶藻弧菌為海洋生物土著菌之一，屬條件致病菌，可以人畜共患[12-14]；一旦暴發(fā)具有發(fā)病迅速、死亡率高、流行面廣等特點(diǎn)，造成社會(huì)經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)也嚴(yán)重威脅著人類的生命安全[3]?？股氐氖褂靡欢葴p少了水產(chǎn)動(dòng)物疾病的暴發(fā)，但是近些年抗生素濫用的潛在危害也相繼出現(xiàn)，例如抗生素耐藥及殘留，不僅導(dǎo)致環(huán)境不斷惡化，而且其通過食物鏈的傳遞對(duì)人類食品安全產(chǎn)生了巨大危害[15，16]。在當(dāng)前禁抗限抗背景下，水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)更加偏向于中草藥的使用，不僅由于其綠色無污染，更是由于其具有顯著的抗菌抗病毒功效[17-19]。深入開展中草藥在水產(chǎn)動(dòng)物防治中的運(yùn)用研究，是實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)綠色環(huán)保、高效生態(tài)的重要發(fā)展方向。

本研究以前期發(fā)病卵形鯧鲹上分離的溶藻弧菌為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。首先，通過在多種中草藥中逐個(gè)篩選，確定抑菌效果較好的中草藥做進(jìn)一步深入研究；然后，探究其不同濃度水提物的抑菌效果，確定其殺菌濃度及最小抑菌濃度；最后，通過胞內(nèi)乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase， LDH)含量的測(cè)定來分析其潛在的殺菌機(jī)制。分析該中草藥水提物對(duì)溶藻弧菌的抑制作用，確定其水提物導(dǎo)致溶藻弧菌的死亡機(jī)制，可為今后研發(fā)抗病漁用中草藥制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

溶藻弧菌(編號(hào)為TOQZ01)分離自廣西欽州灣網(wǎng)箱養(yǎng)殖中發(fā)病的卵形鯧鲹，并超低溫保存于廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。白茅根、薄荷、鵝不食草、威靈仙、雞骨草、青蒿、梔子、桑葉、田基黃，均購(gòu)自廣西南寧一心大藥房；0.22 μm微孔濾柱購(gòu)自Millipore；LB培養(yǎng)基、LB瓊脂平板和TCBS培養(yǎng)基等購(gòu)自廣州環(huán)凱微生物有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和乳酸脫氫酶測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。生化培養(yǎng)箱購(gòu)自上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo公司，超凈工作臺(tái)為AIRTECH。

1.2 方法

1.2.1 溶藻弧菌菌液的制備

將保存的溶藻弧菌劃線接種于瓊脂平板，28℃培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落接入LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)6 h，采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)；將菌液稀釋至1×106cfu/mL，并置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 中草藥水提物的制備

將白茅根、薄荷、鵝不食草、威靈仙、雞骨草、青蒿、梔子、桑葉、田基黃9種中草藥分別用A、B、C、D、E、F、G、H、I表示。

將各中草藥分別烘干至恒質(zhì)量，于干燥器中冷卻后粉碎，過100目篩濾網(wǎng)。分別稱取50 g中草藥粉末，超純水中4℃浸泡過夜；中草藥經(jīng)文火煎煮濃縮后，武火收汁，用4層滅菌紗布過濾藥液；將藥液稀釋至中草藥含量為500 mg/mL，4℃冰箱中避光保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们敖?jīng)13 400 g離心3 min，上清液即為中草藥水提物。

1.2.3 中草藥的初篩

將溶藻弧菌37℃搖床180 r/m培養(yǎng)19 h，3 000 g離心5 min，棄上清，用已滅菌的生理鹽水洗2次，再用生理鹽水重懸至OD600等于0.03，即為溶藻弧菌的初始工作濃度。將溶藻弧菌接入無菌的96孔板中，每孔10 μL，實(shí)驗(yàn)組加入100 μL 中草藥水提物原液，對(duì)照組加入100 μL滅菌生理鹽水，空白組為110 μL滅菌生理鹽水，4℃放置2 h、28℃孵育6 h，測(cè)OD600。抑制率=[1-(OD600實(shí)驗(yàn)組-OD600空白組)/(OD600對(duì)照組-OD600空白組)]×100%。

1.2.4 半致死濃度的測(cè)定

半致死濃度(即抑制率達(dá)到50%以上)測(cè)定采用二倍稀釋法。首先，用二倍稀釋法將中草藥水提物在LB培養(yǎng)基中逐級(jí)稀釋至500.00，250.00，125.00，62.50，31.25，15.625，7.80，0 mg/mL；接著，將溶藻弧菌菌液接入8個(gè)濃度梯度的藥液中(保證菌液初始菌濃度為1×107CFU/mL)，以中草藥水提物濃度0 mg/mL組作為對(duì)照組(P-Con)，4℃放置2 h、28℃孵育6 h，3 000 g離心10 min，用500 μL滅菌的生理鹽水清洗2次后，重懸于200 μL滅菌生理鹽水中；然后，以滅菌生理鹽水作為孔板對(duì)照，用分光光度計(jì)分別測(cè)定600 nm處波長(zhǎng)；最后，計(jì)算中草藥水提物對(duì)溶藻弧菌的抑制率，其計(jì)算公式見1.2.3節(jié)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)菌內(nèi)乳酸脫氫酶(LDH)含量的測(cè)定

將過夜培養(yǎng)的溶藻弧菌3 000 g離心5 min，經(jīng)滅菌生理鹽水洗2次后，生理鹽水重懸；分別取900 μL LB (Con組)和中草藥水提物(Test組)，同時(shí)加入100 μL溶藻弧菌，保證每管的初始菌濃度為1×109CFU/mL，每組3個(gè)重復(fù)；4℃放置2 h，然后28℃搖床培養(yǎng)，分別在2，4，6，8 h取樣，測(cè)定細(xì)菌內(nèi)的LDH含量。具體方法如下：

(1)LDH工作液的配制：20 μL乳酸溶液+20 μL 2-p-iodophenyl-3-nitrophenyl tetrazolium chloride (INT)溶液+20 μL酶溶液；

(2)將處理好的樣品3 000 g離心5 min，生理鹽水洗2次；

(3)加入200 μL 20%的LDH釋放劑，室溫靜置1 h；

(4) 8 000 g離心5 min后，取120 μL上清液加入60 μL LDH工作液，室溫避光孵育30 min，測(cè)定OD490。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用Excel 2010及SPSS 26軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)，采用非參數(shù)T檢驗(yàn)及卡方檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 中草藥水提物抑菌效果的初篩

圖1為9種中草藥水提物對(duì)溶藻弧菌存活率的影響。從圖1a中可以看出白茅根(A)、薄荷(B)、雞骨草(E)、桑葉(H)對(duì)細(xì)菌的存活率沒有影響，和對(duì)照組相比無顯著性差異；鵝不食草(C)、威靈仙(D)、青蒿(F)、梔子(G)、田基黃(I)對(duì)細(xì)菌的存活率都有一定的抑制作用，與對(duì)照組相比具有極顯著性的差異。圖1b為5種中草藥水提物對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用，其中鵝不食草(C)、威靈仙(D)、青蒿(F)、梔子(G)、田基黃(I)對(duì)溶藻弧菌抑制率分別為48.02%，97.43%，80.97%，56.50%，69.64%，但是只有D組威靈仙水提物抑菌濃度超過90%，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用威靈仙水提物進(jìn)行致死機(jī)制研究。

2.2 威靈仙水提物對(duì)溶藻弧菌的抑制作用

如圖2所示，當(dāng)威靈仙水提物濃度大于125 mg/mL時(shí)，威靈仙水提物對(duì)溶藻弧菌的抑制作用隨著濃度的降低而下降；當(dāng)濃度為125 mg/mL時(shí)，對(duì)溶藻弧菌的抑制效果最弱，與對(duì)照組無顯著性差異，其抑制率見圖3a；當(dāng)濃度為500，250和125 mg/mL時(shí)，對(duì)溶藻弧菌的抑制率分別為90.09%，37.00%，4.85%；當(dāng)濃度小于125 mg/mL時(shí)，對(duì)溶藻弧菌的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，且在一定范圍內(nèi)隨著濃度的升高而降低，在62.5 mg/mL達(dá)到最大值，是對(duì)照組的2.03倍，見圖3b。

A:白茅根; B:薄荷;C:鵝不食草;D:威靈仙;E:雞骨草;F:青蒿;G:梔子;H:桑葉;I:田基黃;**：表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01);Ns：表示與對(duì)照組相比差異不顯著

圖3 威靈仙水提物對(duì)溶藻弧菌的作用效果

**：表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01);Ns：表示與對(duì)照組相比差異不顯著

2.3 威靈仙水提物抑菌機(jī)制的研究

圖4為溶藻弧菌的生長(zhǎng)曲線。由圖4可以看到：在4 h內(nèi)，溶藻弧菌生長(zhǎng)處于對(duì)數(shù)期，OD600值隨著時(shí)間的推移逐漸增大；在4 h時(shí)，OD600值達(dá)到最大，而4 h以后，OD600值達(dá)到穩(wěn)定，且到達(dá)了平穩(wěn)期。

圖4 溶藻弧菌生長(zhǎng)曲線

圖5為威靈仙水提物對(duì)溶藻弧菌胞內(nèi)LDH釋放量的影響。圖5a為不同時(shí)間OD490的變化，可以看出對(duì)照組OD490隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加，在6 h達(dá)到最大值，隨后在8 h時(shí)出現(xiàn)下降趨勢(shì)，但各實(shí)驗(yàn)組OD490均低于對(duì)照組，且隨著時(shí)間的推移釋放量逐漸減弱。圖5b為各實(shí)驗(yàn)組胞內(nèi)LDH的釋放量，其中2,4,6,8 h的LDH釋放量分別為24.11,9.21,7.43,7.44 mU/mL。

圖5 威靈仙水提物對(duì)溶藻弧菌胞內(nèi)LDH的影響

3 討論

中草藥是我國(guó)文化的瑰寶，臨床使用從古至今已有幾千年的歷史。馮銳基等[20]研究發(fā)現(xiàn)：五倍子對(duì)溶藻弧菌的抑菌圈直徑為(16.37±0.14) mm，MIC和MBC均為6.25 mg/mL；石榴皮對(duì)溶藻弧菌的抑菌圈直徑為(12.37±0.06) mm，MIC和MBC分別為12.50,25.00 mg/mL。 李赫等[21]研究發(fā)現(xiàn)：茯苓對(duì)嗜水氣單胞菌的MIC 為 15.63 mg/mL，小茴香、昆布和姜黃對(duì)嗜水汽單胞菌的MIC 均為 31.25 mg/mL；丁香和黃芪對(duì)類志賀鄰單胞菌的 MIC分別為 31.25和 62.5 mg/mL。這些研究結(jié)果均表明中草藥對(duì)溶藻弧菌有很好的抑制效果。本研究結(jié)果顯示，9種中草藥對(duì)溶藻弧菌均有一定的抑制效果，其中鵝不食草、威靈仙、青蒿、梔子、田基黃均有抑制溶藻弧菌的作用，而且威靈仙、青蒿、梔子、田基黃可以達(dá)到半致死濃度(抑制率大于50%)，尤以威靈仙的抑菌效果最好。結(jié)果與前人研究報(bào)道一致，說明有很多中草藥對(duì)溶藻弧菌均可以產(chǎn)生很好的抑制作用。

在不同濃度威靈仙水提物對(duì)溶藻弧菌的抑制作用研究中，當(dāng)水提物濃度為500 mg/mL時(shí)，其對(duì)溶藻弧菌的抑制率可達(dá)到90.09%(當(dāng)抑制率大于90%時(shí)即達(dá)到細(xì)菌致死濃度)，故500 mg/mL為威靈仙水提物對(duì)溶藻弧菌的致死濃度。在一定濃度范圍內(nèi)，威靈仙水提物對(duì)溶藻弧菌的抑制率隨著濃度降低而降低，當(dāng)濃度為125 mg/mL時(shí)抑制率最低，僅為5.29%，與對(duì)照組無顯著性差異；在本實(shí)驗(yàn)中，威靈仙水提物濃度小于125 mg/mL時(shí)，其對(duì)溶藻弧菌的生長(zhǎng)起促進(jìn)作用(在62.5 mg/mL時(shí)促進(jìn)效果最明顯，是對(duì)照組的2倍)，且在一定濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的降低其促進(jìn)效果逐漸降低，在7.8 mg/mL時(shí)達(dá)到最低值，僅為對(duì)照組的1.15倍。也就是說，在250-500 mg/mL時(shí)，威靈仙水提物對(duì)溶藻弧菌具有很好的抑制作用；當(dāng)濃度低于125 mg/mL時(shí)，威靈仙水提物具有促進(jìn)溶藻弧菌生長(zhǎng)的作用，且當(dāng)濃度低于62.5 mg/mL時(shí)，隨著濃度的降低促進(jìn)效果逐漸減弱。Liu等[22]使用金銀花水提物及其單體對(duì)石斑魚虹彩病毒進(jìn)行抑制作用研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)也存在濃度依賴性——隨著濃度的降低抗病毒效果逐漸減弱。徐曉津等[23]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方中草藥對(duì)溶藻弧菌有較好的抑制作用，且具有濃度依賴性。以上結(jié)果均與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,可見威靈仙具有潛在的抑制溶藻弧菌的作用，且具有一定的濃度依賴性。

中草藥對(duì)細(xì)菌的抑制作用機(jī)制有很多種[24]，本研究通過對(duì)乳酸脫氫酶的釋放量來判定其作用方式。LDH是糖代謝通路中重要的限速酶之一，是連接各種細(xì)胞代謝的樞紐，直接和間接地激活信號(hào)傳導(dǎo)途徑和調(diào)控免疫應(yīng)答[25]，所以胞內(nèi)LDH的含量可以直接反映細(xì)胞的存活狀態(tài)，被看作是細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)。從圖5a可以看出，在不同時(shí)間點(diǎn)，對(duì)照組OD490值一直保持一個(gè)平穩(wěn)上升的趨勢(shì)，在6 h達(dá)到最大值，而8 h則出現(xiàn)一定的下降趨勢(shì)，說明在前6 h細(xì)菌一直在穩(wěn)定地生長(zhǎng)，所以胞內(nèi)LDH含量逐漸上升，但在8 h細(xì)菌生長(zhǎng)已經(jīng)達(dá)到穩(wěn)定期，細(xì)菌生存環(huán)境下降，導(dǎo)致部分細(xì)菌死亡，故而胞內(nèi)LDH含量降低，這與其生長(zhǎng)曲線結(jié)果(圖4)一致。圖5b是加入威靈仙水提物的實(shí)驗(yàn)組，可以看到胞內(nèi)LDH含量明顯低于對(duì)照組，這可能是由于威靈仙水提物對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞膜產(chǎn)生了一定的破壞，導(dǎo)致胞內(nèi)LDH流失，LDH含量降低，并且在4,6,8 h胞內(nèi)LDH的含量基本達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)，可見隨著時(shí)間的推移細(xì)菌已被部分殺死，或者已經(jīng)沒有細(xì)菌繼續(xù)生長(zhǎng)，故LDH的釋放量逐漸減弱或趨于平穩(wěn)。這就說明威靈仙水提物對(duì)溶藻弧菌的抑制作用體現(xiàn)在細(xì)胞膜的破壞上，這種破壞效應(yīng)導(dǎo)致了胞內(nèi)的LDH大量釋放。綜上，威靈仙是一種發(fā)展綠色高效抗致病性溶藻弧菌制劑的潛在藥物，未來我們將進(jìn)一步系統(tǒng)研究威靈仙對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物其他致病菌的作用，同時(shí)致力于活體水平研究威靈仙對(duì)機(jī)體免疫力的調(diào)控作用。

4 結(jié)論

本研究證實(shí)了威靈仙水提物對(duì)致病性溶藻弧菌具有抑制作用，并對(duì)其抗菌機(jī)制進(jìn)行了研究。通過二倍稀釋法，確定了威靈仙水提物對(duì)溶藻弧菌的致死濃度為500 mg/mL，最小抑菌濃度為250 mg/mL；通過檢測(cè)胞內(nèi)LDH含量，確定威靈仙水提物對(duì)溶藻弧菌的致死機(jī)制可能是通過破壞其細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)容物釋放從而引起菌體裂解。因此，威靈仙有望發(fā)展成為一種高效抗水產(chǎn)病原菌的中草藥制劑。