鄭美玲，魏春莉，劉曉燕，傅俊江

西南醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究中心·四川省高校表觀遺傳與腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（瀘州 646000）

腫瘤是機(jī)體在各種異常因素作用下產(chǎn)生的新生物，其中惡性腫瘤為醫(yī)療界的一大難題，它嚴(yán)重威脅人類的生命健康，是全球發(fā)病率和死亡率的主要原因之一，其中50歲以上女性乳腺癌發(fā)生率為80%以上。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在目前已知的各種惡性腫瘤中，由于絕大多數(shù)患者對(duì)該病不夠重視，社會(huì)科普體系不健全及醫(yī)院早期診斷、治療機(jī)制不完善等客觀因素?zé)o法在短時(shí)間內(nèi)解決，也在很大程度上增加了惡性腫瘤的病死率[1-3]。同時(shí)由于腫瘤的致病因素、易感基因、腫瘤轉(zhuǎn)移、相同腫瘤的不同類型和血管生成機(jī)制等與該病有關(guān)的各種因素尚未完全清楚[3]，也在某種程度上阻礙了上述各種客觀因素的有序推進(jìn)。

值得注意的是，既往研究中所構(gòu)建二肽酶1（de?hydropeptidase-1，DPEP1）基因表達(dá)載體研究與DPEP1 蛋白表達(dá)相關(guān)研究[4]，揭示DPEP1 的某些生物學(xué)新功能與大腸癌、結(jié)腸癌中呈高表達(dá)的同時(shí)還與其癌癥病理標(biāo)本和負(fù)相關(guān)參數(shù)的侵略性和不良預(yù)后均有密切相關(guān)。DPEP1 可能通過降解基質(zhì)屏障來促進(jìn)細(xì)胞遷移和血管生成[5]。同時(shí)也有研究證實(shí)，DPEP1 的這種新生物學(xué)特性在腫瘤的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲中也存在。既往研究還證實(shí)[6]，腫瘤細(xì)胞侵襲性也會(huì)受DPEP1 的過度表達(dá)抑制，吉西他濱（gem?citabine），一種化學(xué)治療劑，治療時(shí)的敏感性也會(huì)在DPEP1 的影響下遞增，表皮細(xì)胞生長因子（epider?mal growth factor，EGF）治療可減少DPEP1表達(dá)。

DPEP1 基因（NM_004413.4）屬于肽酶M19 家庭，它定位于人類染色體16q24.3。DPEP1長度為28 233堿基對(duì)，含9 個(gè)外顯子和8 個(gè)內(nèi)含子；它編碼411 氨基酸，預(yù)測分子量為45 674道爾頓。

研究DPEP1 調(diào)控蛋白水平、穩(wěn)定性和在腫瘤癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲中的作用，對(duì)拓展腫瘤新的治療靶點(diǎn)、靶標(biāo)等具有重要意義，也可為腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究提供有價(jià)值的參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

1.1.1 試劑DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和Opti-MEM培養(yǎng)基購自GIBCO 公司；EcoR V 和Nhe I 購自BIO-RAD；DPEP1 質(zhì)粒購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；One-Step RT-PCR Kit及PCR產(chǎn)物回收試劑盒（德國QIAGEN公司）、Taq plus DNA聚合酶（上海生工生物工程公司）、Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司）、Cell Counting Kit-8 試劑盒（CCK-8）購自日本同仁化學(xué)研究所等，其他試劑盒則參照使用說明書。載體pcD?NA5/FRT/TO、大腸桿菌DH5α、HEK-293 細(xì)胞系、HeLa細(xì)胞系、MDA-MB-231細(xì)胞系、BT549細(xì)胞系、潮霉素B、氨芐青霉素由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要儀器熒光倒置顯微鏡（日本Olympus 公司，型號(hào)：IX81）、超低溫冰箱（美國Thermo公司）、高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo 公司）、熒光實(shí)時(shí)定量PCR 儀及PCR 分析儀（美國ABI 公司）、BIO-RAD 雙向電泳分析系統(tǒng)（美國伯樂公司，型號(hào)：Bio-Rad Mini-protean Tetra cell）、全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）等。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)步驟設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案（見圖1）后按相關(guān)步驟開展各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。①應(yīng)用Primer Express 2.0 軟件設(shè)計(jì)DPEP1（NCBI基因庫序列號(hào)：NM_004413）引物和探針獲取DPEP1 的cDNA 序列（見表1）。②實(shí)驗(yàn)步驟：以已有DPEP1 cDNA基因?yàn)槟０暹M(jìn)行高保-聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增DPEP1 全長基因。將pcDNA5/FRT/T0 表達(dá)載體用EcoR V和Nhe I雙酶切消化后與相同內(nèi)切酶消化的DPEP1 連接，并獲取pcDNA5/FRT/T0/DPEP1。接著進(jìn)行陽性克隆篩選以獲得陽性克隆。最后轉(zhuǎn)染細(xì)胞系過表達(dá)，并應(yīng)用Western blot檢測DPEP1的表達(dá)情況。

表1 DPEP1引物序列表

1.2.2 PCR擴(kuò)增及克?、俜磻?yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1.5 min，94 ℃40 s、65 ℃30 s、72 ℃2 min 進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)，接著在72℃條件下延伸2 min，16 ℃保存。②PCR 產(chǎn)物純化：所有的PCR 產(chǎn)物均經(jīng)EcoR V、Nhe I雙酶切后膠回收純化處理，然后連入載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中并隨機(jī)挑選克隆提質(zhì)粒和電泳，鑒定并將初篩的陽性克隆菌液進(jìn)行基因測序（Sanger測序法）。重組質(zhì)粒命名為pcDNA5-DPEP1。

1.2.3 DPEP1 質(zhì)粒的擴(kuò)增和提取將重組質(zhì)粒DPEP1克隆于氨芐青霉素陽性的LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基（37 ℃）中過夜，培養(yǎng)結(jié)束后提取質(zhì)粒。進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測質(zhì)粒提取質(zhì)量。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及構(gòu)建細(xì)胞系將在含有完全培養(yǎng)基DMEM，10%胎牛血清的12 孔培養(yǎng)基中培養(yǎng)的HeLa 和BT549 細(xì)胞密度達(dá)到70%左右時(shí)，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建的pcDNA5-DPEP1 質(zhì)粒和pcDNA5質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。取3支已滅菌1.5 mL離心管，向各管分別加入OPTI-MEM、質(zhì)粒、空質(zhì)粒，再按順序分別加入Lipofectamine?3000、P3000?、P3000?后，室溫靜置10 min，再將含有Lipofectamine?3000混合液均分至另外兩支管并混勻，室溫靜置10 min。處理細(xì)胞后，加入50 μL OPTI-MEM培養(yǎng)基，再緩慢加入已靜置10 min 的DNA-Lipofectamine?3000 復(fù)合物，水平前后左右輕輕推動(dòng)培養(yǎng)板各2 次混勻并在培養(yǎng)板上做好標(biāo)記后，將培養(yǎng)板放置在37 ℃CO2孵育箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)6 h后，吸出培養(yǎng)液，每孔加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基1mL；觀察細(xì)胞情況，第2～3 d 將細(xì)胞傳代[7-13]。潮霉素B 篩選細(xì)胞系，獲得潮霉素B抗性細(xì)胞系。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡雜交（Western Blot）將細(xì)胞蛋白裂解液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electro?pheresis，SDS-PAGE），10%分離膠，5%濃縮膠，蛋白質(zhì)電泳至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，5%脫脂牛奶封膜，搖床1.5 h，分別加入FLAG 或DPEP1 和HSP70 抗體（1∶5 000），搖床4 ℃過夜；再用1×TBST 洗膜3 次，10 min/次。用顯影液在凝膠圖像成像儀曝光，從而用FLAG 抗體和DPEP1 抗體分別檢測DPEP1 蛋白是否成功過表達(dá)。HSP70作為內(nèi)參蛋白[11-15]。

1.2.6 CCK-8 法檢測過表達(dá)細(xì)胞系CCK-8 是Cell Counting Kit-8 的簡稱。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞按70%左右的密度接種到96孔板，100 μL/孔。DPEP1質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組、對(duì)照組、空白組均設(shè)置7 個(gè)平行孔，24 h 后加入10 μL/孔的CCK-8 溶液，培養(yǎng)2 h 后，置于全長酶標(biāo)儀450 nm處測各孔的吸光度（OD值）[16-18]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 DPEP1 cDNA擴(kuò)增

以DPEP1 基因的cDNA 作為模板，高保真PCR多聚酶擴(kuò)增，獲得DPEP1 基因片段，再經(jīng)用EcoR V和Nhe I雙酶切消化后和純化，獲得用于克隆中連接所需要的純化DPEP1片段。

2.2 鑒定重組質(zhì)粒pcDNA5-DPEP1

采用PCR檢測和EcoR V和Nhe I雙酶切消化與相同內(nèi)切酶消化的DPEP1重組質(zhì)粒pcDNA5-DPEP1，獲得pcDNA5/FRT/TO/DPEP1，得到與理論片段相符的1 個(gè)質(zhì)粒。圖2A 是陽性克隆經(jīng)PCR 鑒定結(jié)果（黑色箭頭標(biāo)示所擴(kuò)增的開放閱讀框片段大小）；圖2B是陽性克隆經(jīng)EcoR V 和Nhe I 雙酶切鑒定的結(jié)果（紅色箭頭標(biāo)示所酶切的DPEP1 片段）。然后進(jìn)行Sanger 測序分析，該基因的Sanger 測序分析證明其與DPEP1（NCBI 基因庫序列號(hào)：NM_004413.4；1 233 bp）序列一致（結(jié)果未顯示）。

圖2 DPEP1基因陽性克隆的PCR（A）和酶切鑒定（B）

2.3 DPEP1蛋白過表達(dá)分析

構(gòu)建過表達(dá)DPEP1 質(zhì)粒pcDNA5-DPEP1 并成功構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系BT549，提取蛋白進(jìn)行Western blot 分析，結(jié)果顯示我們成功地檢測到DPEP1 蛋白的過表達(dá)（圖3A，通道1 和2），而陰性對(duì)照無表達(dá)（圖3A，通道Ctrl）。經(jīng)對(duì)目的蛋白DPEP1 過表達(dá)的WB條帶灰度值進(jìn)行分析，通道1的值約是通道對(duì)照組（ctrl）的20.16 倍，通道2 的值約是ctrl 的18.13 倍（圖3B）。DPEP1蛋白過表達(dá)成功證明建立了穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。

圖3 DPEP1蛋白的過表達(dá)及WB條帶灰度分析

2.4 DPEP1的生長分析

過表達(dá)DPEP1 細(xì)胞系進(jìn)行CCK-8 檢測，BT549過表達(dá)組吸光度與其他轉(zhuǎn)染組細(xì)胞系進(jìn)行吸光度分析。其結(jié)果以不同組為橫坐標(biāo)、OD 值為縱坐標(biāo)作柱狀圖顯示（圖4）。DPEP1 過表達(dá)組與非DPEP1 過表達(dá)對(duì)照組、空載體質(zhì)粒組之間的OD 值差異不大（分別為P=0.054，P=0.092，P=0.87），無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），證明DPEP1對(duì)腫瘤細(xì)胞生長無影響。

圖4 DPEP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的OD值柱狀圖

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，在導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生的各種危險(xiǎn)因素（如未婚，未育，晚育，未哺乳等）中經(jīng)期的早（月經(jīng)初潮<12歲）、遲（絕經(jīng)>55歲）尤顯著，結(jié)腸癌主要以腹脹、消化不良、排便習(xí)慣改變等消化道癥狀為主，而子宮頸癌中的陰道不規(guī)則流血、排液、疼痛為主要表現(xiàn)，婦科檢查可見宮頸糜爛、潰瘍或菜花狀新生物尤為突出，當(dāng)然與腫瘤相關(guān)的突變基因、易感基因?qū)ζ溆姓{(diào)控作用，機(jī)體攜帶與相關(guān)基因也是可能存在的潛在危險(xiǎn)[19-23]。乳腺癌是最常見的癌癥，也是全世界各地女性因癌癥致死的主要原因以及診斷頻率最高、根治性差的癌癥[18-19]。對(duì)于惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制及對(duì)惡性腫瘤未來的治療方向，主要是將促使癌癥發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的基因和途徑與在其發(fā)展中不發(fā)揮作用的基因和途徑進(jìn)行區(qū)分，及新型靶向治療的研究，而DPEP1的研究作為目前腫瘤生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中探討乳腺癌致病因素及治療新切入靶點(diǎn)之一，有其研究的必要性與迫切性。

作為肽酶M19 家庭的重要成員之一的DPEP1，臨床上又將其稱作神二肽酶或膜二肽酶、微粒體二肽酶。既往研究表明[24-27]，DPEP1在結(jié)腸癌、大腸癌等癌組織中的表達(dá)情況均顯著高于正常組織，其表達(dá)隨病理分化程度的降低而降低，也隨淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況的下降而下降。研究發(fā)現(xiàn)，即使DPEP1 在結(jié)腸癌、大腸癌等癌組織中呈低表達(dá)，但其整體預(yù)后效果不是非常顯著，當(dāng)然這在那些根治性手術(shù)患者中依舊如此[13，28-30]。

本文以DPEP1 的cDNA 基因作為模板，高保真PCR 多聚酶擴(kuò)增而獲得DPEP1 基因片段，再用EcoR V 和Nhe I 雙酶切消化和純化，最終獲得的DPEP1 cDNA 基因序列與DPEP1（NCBI 基因庫序列號(hào)：NM_004413）序列相符。且重組DPEP1 蛋白后獲得了與理論片段相符的質(zhì)粒。而在RAPD 技術(shù)腫瘤組織分析中也發(fā)現(xiàn)，乳腺癌中的DPEP1 表達(dá)有顯著的異常擴(kuò)增特征[26-31]，提示DPEP1 可能影響腫瘤患者的癌細(xì)胞的侵襲性而改變寄主細(xì)胞原有的性狀或癌細(xì)胞的產(chǎn)生提供便利，以及癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移起到促進(jìn)作用，這可能與DPEP1 蛋白在腫瘤細(xì)胞中存在過表達(dá)現(xiàn)象有關(guān)[7，20，29]。在分子生物學(xué)研究中，通常需要基因/蛋白質(zhì)的所需表達(dá)[26]。上述研究均證實(shí)，DPEP1蛋白在腫瘤細(xì)胞中能顯著的過表達(dá)現(xiàn)象。而既往研究[32-34]中的DPEP1 cDNA（結(jié)直腸上皮內(nèi)癌變組織）和蛋白表達(dá)情況與病理特征對(duì)比分析也發(fā)現(xiàn)，二者的表達(dá)趨勢有顯著的一致性，且DPEP1 蛋白水平越高其癌變組織發(fā)生癌變的可能性也越高。同時(shí)也有研究表明[35-36]，DPEP1 的過表達(dá)通過激活PI3K/Akt/mTOR使原本沉默的DPEP1在肝母細(xì)胞瘤中起到癌基因的作用。腫瘤癌變進(jìn)程中表觀遺傳學(xué)的變化能引起抑癌基因失活與原癌基因活化，對(duì)不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移起關(guān)鍵性作用[7，37-41]。結(jié)合上述研究可以推斷，腫瘤患者的DPEP1 表達(dá)量升高是隨著腫瘤病變的發(fā)生、發(fā)展而逐漸發(fā)生轉(zhuǎn)變的，DPEP1表達(dá)在乳腺癌的腫瘤演進(jìn)機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。DPEP1在惡性腫瘤的瘤變過程中存在顯著的過表達(dá)特征，且影響腫瘤細(xì)胞的侵襲性。

綜上所述，此次實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建DPEP1 過表達(dá)載體并成功構(gòu)建乳腺癌BT549 穩(wěn)定細(xì)胞系，并檢測到了DPEP1 蛋白過表達(dá)，對(duì)下游調(diào)控信號(hào)通路及DPEP1 功能的研究可能非常有用。推測DPEP1 在惡性腫瘤的病變過程中可能誘導(dǎo)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘?xì)胞，可能是惡性腫瘤潛在的一個(gè)新治療靶點(diǎn)。但仍需更多的研究予以證實(shí)，而本研究為將來闡明DPEP1基因在腫瘤中的作用及機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了DPEP1 的過表達(dá)載體及穩(wěn)定細(xì)胞株，并獲得DPEP1 蛋白的過表達(dá)。該研究的成功實(shí)施為深入闡明DPEP1 在腫瘤中的作用機(jī)制奠定了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。