王為運(yùn)，夏宇程，鐘江

復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)系，上海 200438

21世紀(jì)初，首個(gè)感染阿米巴原蟲的巨型病毒——擬菌病毒的發(fā)現(xiàn)[1]使人們重新思考病毒的起源和本質(zhì)。這些巨型病毒基因組可超過1 Mbp，編碼近 1 000 種蛋白質(zhì)，遠(yuǎn)超普通病毒。它們還編碼一些其他病毒中罕見的功能基因，特別是與蛋白質(zhì)合成相關(guān)的基因。例如，擬菌病毒科的Tupanvirus和Klosneuvirus的基因組均編碼全套20種氨酰tRNA合成酶和數(shù)十種翻譯因子[2]。

馬賽病毒是繼擬菌病毒之后被發(fā)現(xiàn)的第2類阿米巴巨型病毒。2009年，第一株馬賽病毒在法國馬賽市一處冷卻塔的水樣中通過阿米巴共培養(yǎng)被分離[3]，之后人們又陸續(xù)在突尼斯、塞內(nèi)加爾、澳大利亞、日本、馬來西亞、印度和巴西等地分離出相似病毒[4-11]。2018年，國內(nèi)首次報(bào)道了馬賽病毒上海株(Mar-SH2016)[12]。對(duì)Mar-SH2016基因組進(jìn)行注釋發(fā)現(xiàn)，它和其他馬賽病毒一樣，編碼4種潛在翻譯因子，分別是類翻譯延伸因子G結(jié)構(gòu)蛋白(ORF110)、真核生物多肽鏈釋放因子eRF1(ORF139)、翻譯延伸因子EF1a(ORF173)以及真核翻譯起始因子eIF2/eIF5(ORF314)，但這些因子在馬賽病毒復(fù)制過程中的功能尚未得到深入研究。

真核生物蛋白質(zhì)翻譯過程是一個(gè)受細(xì)胞精密調(diào)控的過程，包括起始、延伸和終止3個(gè)階段，其中起始階段至關(guān)重要，需要細(xì)胞內(nèi)一系列物質(zhì)的參與。真核翻譯起始因子通過與核糖體、mRNA以及起始tRNA之間的相互作用控制蛋白翻譯的起始，目前已發(fā)現(xiàn)了至少12種。Mar-SH2016編碼的ORF314基因全長453 bp，編碼151個(gè)氨基酸(amino acid，aa)，蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為17.3×103，與宿主卡氏棘阿米巴(Acanthamoebacastellanii)編碼的eIF2/eIF5氨基酸序列同源性達(dá)60%。

本研究以O(shè)RF314基因?yàn)檠芯繉?duì)象，通過RNA干擾技術(shù)降低其在Mar-SH2016感染的卡氏棘阿米巴細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平，分析其對(duì)病毒復(fù)制的影響，以期為揭示這些病毒編碼的相關(guān)潛在翻譯因子的功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及病毒卡氏棘阿米巴Neff株(ATCC 30010)購自美國菌種保藏中心，用PYG(peptone-yeast extract with glucose)培養(yǎng)基于 25 ℃ 靜置培養(yǎng)[13]。馬賽病毒上海株Mar-SH2016(GenBank登錄號(hào)：MG827395)由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2 引物及抗體根據(jù)Mar-SH2016編碼的eIF2/eIF5(ORF314)基因序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)引物，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，上游引物為5’-CTTGGTACGAGCTCCGGTTT-3’，下游引物為5’-CCACAACCTCTGCAGGACAT-3’?？筄RF314抗體用本實(shí)驗(yàn)室免疫小鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司)制備，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記兔抗小鼠IgG購自生工生物工程(上海)股份有限公司，基礎(chǔ)型化學(xué)發(fā)光檢測試劑購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 靶向ORF314基因的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)制備根據(jù)RNA干擾設(shè)計(jì)原則，針對(duì)Mar-SH2016編碼的eIF2/eIF5(ORF314)基因設(shè)計(jì)3對(duì)siRNA，另設(shè)計(jì)1對(duì)無義siRNA為陰性對(duì)照(negative control，NC)，序列如表1所示。針對(duì)靶基因的siRNA采用5’CY3修飾，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染將卡氏棘阿米巴于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)至密度為105cell/mL，移除PYG培養(yǎng)基，用PAS鹽溶液(按ATCC Meidum 1323標(biāo)準(zhǔn)配方配制)完全浸沒細(xì)胞，輕輕漂洗2～3次后加入適量新鮮PYG培養(yǎng)基。參照Lipofectamin RNAiMAX(Invitrogen)說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，siRNA終濃度為100 nmol/L。轉(zhuǎn)染后于25 ℃靜置培養(yǎng)3 h，滴加Mar-SH2016病毒懸液，感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)約為10，1 h后用PAS鹽溶液輕輕漂洗細(xì)胞，除去未吸附的病毒，重新加入適量PYG培養(yǎng)基，于25 ℃靜置培養(yǎng)，定時(shí)收集細(xì)胞。

1.2.3 轉(zhuǎn)染效率熒光檢測將5’CY3修飾的siRNA轉(zhuǎn)染卡氏棘阿米巴細(xì)胞4 h后，用CKX41熒光倒置顯微鏡(Olympus)紅色激發(fā)光對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察，攝影記錄轉(zhuǎn)染細(xì)胞的比例。

表1 靶向ORF314基因的siRNA序列

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)檢測ORF314基因mRNA表達(dá)水平將卡氏棘阿米巴于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板用PYG培養(yǎng)基培養(yǎng)(25 ℃)至細(xì)胞匯合度為70%～90%(密度約為105cell/mL)，加入Mar-SH2016病毒懸液(MOI約為10)，感染1 h后小心移去PYG培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)輕輕漂洗3次，加入適量新鮮培養(yǎng)基，于25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。收集不同感染時(shí)間的細(xì)胞，用RNAiso Plus(TaKaRa)試劑盒抽提細(xì)胞總RNA，用PrimeScript RT reagent kit with gDNA eraser(TaKaRa)試劑盒對(duì)其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以此cDNA為模板，以細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素B基因?yàn)閮?nèi)參，用BlasTaqTM2X qPCR MasterMix(ABM)試劑盒進(jìn)行RT-qPCR檢測。

1.2.5 ORF314基因干擾效果鑒定于4 ℃ 500 g離心5 min，收集siRNA干擾后的卡氏棘阿米巴細(xì)胞沉淀，用RNAiso Plus試劑盒抽提細(xì)胞總RNA，利用RT-qPCR檢測干擾后的ORF314基因mRNA表達(dá)水平。用棘阿米巴細(xì)胞裂解液[20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6；300 mmol/L NaCl；20 mmol/L KCl；6 mmol/L MgCl2；1% Triton X-100；1 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)]裂解細(xì)胞沉淀，提取蛋白，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)和蛋白免疫印跡法檢測干擾后的ORF314基因蛋白表達(dá)水平。

1.2.6 病毒毒力測定Mar-SH2016感染后6 h收集siRNA干擾后的細(xì)胞懸液，反復(fù)凍融3次，以釋放病毒顆粒，離心(500 g，5 min)收集含有病毒的上清液。向96孔板中每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，密度約為4×104cell/mL，于25 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min至細(xì)胞貼壁，將含有病毒的上清液用PBS進(jìn)行10倍系列稀釋至10-11。吸取100 μL病毒稀釋液，緩慢滴加至含有細(xì)胞的孔板中，于25 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d，顯微鏡下觀察，以出現(xiàn)明顯的滋養(yǎng)體細(xì)胞裂解死亡為陽性，用Reed-Muench法計(jì)算病毒毒力(TCID50)[14]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ORF314基因在Mar-SH2016感染細(xì)胞中的表達(dá)動(dòng)態(tài)

Mar-SH2016感染卡氏棘阿米巴(MOI約為10)后一定時(shí)間收取阿米巴細(xì)胞，采用RT-qPCR分析ORF314基因的轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)，以細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素B基因?yàn)閮?nèi)參。結(jié)果顯示，ORF314基因在Mar-SH2016感染的宿主細(xì)胞中得到表達(dá)(見圖1)。感染后1.5 hORF314基因已有所表達(dá)，隨后表達(dá)水平持續(xù)升高，感染后8 h達(dá)到峰值，且一直持續(xù)至感染后16 h。

圖1 Mar-SH2016潛在翻譯因子ORF314的轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)

2.2 siRNA轉(zhuǎn)染卡氏棘阿米巴的效果

用5’CY3修飾的siRNA轉(zhuǎn)染卡氏棘阿米巴細(xì)胞，4 h后在熒光顯微鏡紅色激發(fā)光下可以觀察到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分布著一些紅色熒光顆粒，細(xì)胞外也有一些游離的帶有熒光的siRNA復(fù)合物(見圖2)。結(jié)果顯示，1/3以上的細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染siRNA。

A: Bright field microscopy. B: Florescent microscopy with red excitation light.

2.3 siRNA干擾后ORF314基因表達(dá)下調(diào)

根據(jù)ORF314基因序列設(shè)計(jì)3對(duì)siRNA和1對(duì)無義siRNA，轉(zhuǎn)染卡氏棘阿米巴3 h后用Mar-SH2016感染(MOI約為10)。采用RT-qPCR和蛋白免疫印跡法，測定ORF314基因表達(dá)水平，結(jié)果如圖3所示。與轉(zhuǎn)染無關(guān)siRNA的陰性對(duì)照相比，靶向ORF314基因的3對(duì)siRNA中有2對(duì)能顯著降低其mRNA表達(dá)水平(P<0.01)，編號(hào)分別是314-1和314-1.9(見圖3A)。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照相比，同樣是編號(hào)為314-1和314-1.9的2對(duì)siRNA干擾后的ORF314基因蛋白表達(dá)量降低(見圖3B)。

2.4 siRNA干擾ORF314基因表達(dá)后Mar-SH2016毒力降低

將靶向ORF314基因的3對(duì)siRNA轉(zhuǎn)染卡氏棘阿米巴，3 h后用Mar-SH2016感染(MOI約為10)。感染后6 h以卡氏棘阿米巴作為宿主細(xì)胞測定病毒毒力，結(jié)果如圖4所示。與轉(zhuǎn)染無關(guān)siRNA的陰性對(duì)照相比， 3對(duì)siRNA中有2對(duì)能顯著降低Mar-SH2016的毒力(P<0.01)，編號(hào)分別是314-1和314-1.9，與干擾ORF314基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成的結(jié)果一致。Mar-SH2016毒力下降約30%，表明ORF314基因表達(dá)被干擾后Mar-SH2016的正常復(fù)制受到一定影響。

A: Transcriptional level of ORF314 in Mar-SH2016-infected cells after siRNA interference by RT-qPCR (**P<0.01 compared with NC). B: Protein expression of ORF314 in Mar-SH2016-infected cells after siRNA interference by Western blotting. ORF314: the purified ORF314 protein expressed in prokaryotic cells; A.c.-ORF314: cell lysates of Acanthamoeba castellanii after virus infection; Si-314-1, Si-314-1.9, Si-314-3 and Si-NC: cell lysates of Acanthamoeba castellanii transfected with three pairs of siRNA against ORF314 and control siRNA, respectively.

NC: cells treated with control siRNA; 314-1, 314-1.9, 314-3: cells transfected with three pairs of siRNA against ORF314. **P<0.01 compared with NC.

3 討論

大部分已知的巨型病毒基因組中超過一半的假定基因尚沒有明確的功能注釋[15]，只有小部分?jǐn)M菌病毒蛋白的功能得到了研究，包括一些氨基酰-tRNA合成酶[16-17]和參與糖生物合成的蛋白[18]。Sobhy等[19]首次利用RNA干擾技術(shù)降低擬菌病毒相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)擬菌病毒纖毛的形成可能與功能未知的L725蛋白和L829蛋白、注釋功能為氧化還原酶的R135蛋白以及屬于TPR蛋白超家族[20-22](介導(dǎo)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、病毒與宿主之間相互作用以及調(diào)節(jié)病毒復(fù)制的一類蛋白質(zhì))的R856蛋白有關(guān)，敲低這4個(gè)基因?qū)M菌病毒的纖毛形成有影響。Zinoviev等[23]對(duì)擬菌病毒科和馬賽病毒科病毒編碼的潛在翻譯延伸因子1家族的GTPase(trGTPase)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，前者的trGTPase與GTP結(jié)合蛋白1(GTP binding protein 1，GTPBP1)的關(guān)系密切，在翻譯延伸過程中能將同源氨基酰-tRNA傳遞到核糖體A位點(diǎn)，而后者的trGTPase與真核生物翻譯延伸因子eEF1A、多肽鏈釋放因子eRF3和mRNA檢測因子Hbs1的關(guān)系更為密切，具有類似于eRF3的功能，可終止翻譯進(jìn)程并促進(jìn)多肽鏈的釋放。

本研究對(duì)馬賽病毒上海株Mar-SH2016的真核翻譯起始因子eIF2/eIF5(ORF314)進(jìn)行RNA干擾，用RT-qPCR檢測其轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)。結(jié)果顯示，在Mar-SH2016感染宿主卡氏棘阿米巴的過程中，ORF314基因呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)表達(dá)，于約1.5 h內(nèi)開始表達(dá)，感染后8 h表達(dá)量達(dá)到峰值且持續(xù)至感染后16 h。將siRNA轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，用Mar-SH2016感染6 h后ORF314基因表達(dá)水平顯著下降，且病毒毒力顯著降低(P<0.01)，下降近30%，表明病毒的復(fù)制受到影響。將siRNA轉(zhuǎn)染卡氏棘阿米巴細(xì)胞并延長病毒感染時(shí)間至9 h，ORF314基因的表達(dá)不再被siRNA顯著影響(結(jié)果未顯示)。這可能是由于siRNA的干擾效果持續(xù)時(shí)間有限，須進(jìn)一步加大siRNA用量并設(shè)法提高轉(zhuǎn)染效率。

此外，siRNA引起Mar-SH2016毒力降低的幅度遠(yuǎn)低于ORF314基因轉(zhuǎn)錄水平下降的幅度。這可能是因?yàn)轳R賽病毒ORF314基因與宿主棘阿米巴基因組中的氨基酸序列同源性達(dá)60%，可以在一定程度上彌補(bǔ)ORF314水平降低對(duì)病毒復(fù)制的影響。盡管如此，本研究發(fā)現(xiàn)siRNA干擾ORF314基因表達(dá)能顯著抑制Mar-SH2016的早期復(fù)制，提示Mar-SH2016在感染早期可能需要ORF314基因的協(xié)助來進(jìn)行自身蛋白質(zhì)合成，表明從嚴(yán)格意義上來說馬賽病毒編碼的這些與翻譯相關(guān)的基因并不是冗余的。

巨型病毒的發(fā)現(xiàn)改變了以往人們對(duì)病毒的認(rèn)知，對(duì)馬賽病毒的一些重要問題開展深入研究有助于了解此類巨型病毒的復(fù)制機(jī)制，加深對(duì)其本質(zhì)和起源的認(rèn)識(shí)，同時(shí)有助于認(rèn)清其對(duì)人類及其他生物的潛在影響，為進(jìn)一步探究其在生態(tài)系統(tǒng)中的地位和作用提供了理論依據(jù)。