魏孔嬌，王嘉正，邱小彤，徐帥，朱雄，李歡，王曉霞，王成玲，范仕弘，韓李超，劉志國, 李振軍,

1. 西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西藏自治區(qū) 拉薩 850000； 2. 山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院(山東省千佛山醫(yī)院)檢驗醫(yī)學(xué)科，山東省醫(yī)藥衛(wèi)生臨床檢驗診斷學(xué)重點實驗室，山東 濟南 250000； 3. 中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室，北京 102206； 4. 海南省三亞市人民醫(yī)院檢驗科，中心實驗室，海南 三亞 572000

棒狀桿菌屬(Corynebacterium)是一類無芽孢，大多數(shù)菌株為無動力的革蘭染色陽性桿菌，主要寄生在人的鼻腔、咽喉、眼結(jié)膜、外陰、皮膚等部位。一般無致病性，通常被認(rèn)為是皮膚和黏膜的正常菌群[1-2]。然而，近年來已有大量研究表明棒狀桿菌存在潛在致病力，特別是紋帶棒狀桿菌(Corynebacteriumstriatum,Cs)，為多種院內(nèi)感染的病原體，如敗血癥[1]、呼吸道感染[2-3]等。紋帶棒狀桿菌作為條件致病菌，它的多重耐藥性特征使其成為一種院內(nèi)感染病原體，且在免疫力低下人群中的感染率日趨增高[2-6]。為了解我國紋帶棒狀桿菌的藥物敏感性特征，本研究對2017年3月—2020年6月山東省某三甲醫(yī)院臨床分離的83株紋帶棒狀桿菌進行抗菌藥物敏感性檢測，并探討其耐藥機制，期望為該菌的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與試劑主要儀器：生化培養(yǎng)箱(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)、B2生物安全柜(北京東聯(lián)公司)、恒溫金屬浴(北京大龍興創(chuàng)實驗儀器股份有限公司)、基因擴增熱循環(huán)儀(西安天隆科技有限公司)、電泳儀(美國伯樂公司)，超微量分光光度計(德國Lmplen公司)，實時熒光定量PCR儀(西安天隆科技有限公司)。主要試劑：哥倫比亞血平板(英國OXOID公司)，核酸染料Gold View(北京索萊寶科技有限公司)，細(xì)菌基因組DNA、RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]，TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ (日本TAKARA公司)，四環(huán)素鹽酸鹽、紅霉素鹽酸鹽(上海YEASEN公司)，所有試劑均按說明書指定條件保藏并在有效期內(nèi)使用。藥敏板購自上海星佰生物技術(shù)有限公司，均在有效期內(nèi)使用并按產(chǎn)品說明書保存。耐藥基因檢測引物設(shè)計如表1所示，由北京天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司合成。

1.1.2 菌株本研究收集的83株實驗菌株來源于山東某三甲醫(yī)院2017年3月—2020年6月分離的紋帶棒狀桿菌(已剔除重復(fù)菌株)。在哥倫比亞血瓊脂平板上35 ℃過夜培養(yǎng)，并用16SrDNA進行擴增，擴增產(chǎn)物送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進行測序，用blast進行序列比對。細(xì)菌基因組DNA提取嚴(yán)格按照TIANGEN生物公司試劑盒說明的方法進行，并采用紫外分光光度計進行檢測，制備好的DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 實驗用引物設(shè)計

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感性檢測根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推薦的抗菌藥物敏感性實驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)[10]，采用微量肉湯稀釋法檢測83株紋帶棒狀桿菌對12種常用藥物的敏感性，按照CLSI的標(biāo)準(zhǔn)，判定菌株對每種藥物的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)范圍，確定MIC50、MIC90值。肺炎鏈球菌ATCC49619和大腸埃希菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株，標(biāo)準(zhǔn)菌株由中國疾病預(yù)防控制中心提供。以2016年M45-ED3(CLSI)文件[10]作為折點判斷標(biāo)準(zhǔn)，確定12種抗生素的MIC值。所有實驗操作均在P2級生物安全實驗室完成。

1.2.2 耐藥基因檢測采用PCR對四環(huán)素抗性核糖體保護蛋白基因(tetW)、核糖體甲基化酶基因(ermX)、喹諾酮類藥物耐藥基因(gyrA)、3種氨基糖苷類修飾酶基因[aph(3”)-Ⅰb、aph(6)-Ⅰd、aac(6’)-Ⅰb]進行檢測。PCR總反應(yīng)體系25 μL：2ΧPCR Master 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL，DNA模板1 μL。PCR反應(yīng)中使用到的引物信息如表1所示。5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下觀察結(jié)果。陽性產(chǎn)物送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果用blast進行比對分析。

1.2.3 基因表達(dá)差異分析檢測采用微量肉湯稀釋法檢測3株紋帶棒狀桿菌的最低抑菌濃度(見表6)，在不同濃度的紅霉素、環(huán)丙沙星作用下，對ermX和tetW基因的表達(dá)進行干預(yù)。在哥倫比亞血平板上接種紋帶棒狀桿菌，35 ℃過夜培養(yǎng)后取單菌落置于液體腦心浸液肉湯BHI培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min過夜培養(yǎng)。將菌液以1∶100轉(zhuǎn)接于20 mL液體BHI，每種藥物接種3管，其中1管不加藥物作為對照，其余2管分別加入該菌株的50% MIC、25%MIC濃度的該藥物，37 ℃，180 r/min過夜培養(yǎng)。5000 r/min離心10 min，棄上清，之后用去離子水洗3次。按照細(xì)菌總RNA 提取試劑盒說明方法提取細(xì)菌的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明方法將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后按照熒光定量試劑盒說明推薦方法進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系：2ΧSYBR Green 10 μL；上、下游引物各0.4 μL；Rox Reference Dye II 0.4 μL；滅菌蒸餾水6.8 μL；模板2 μL。擴增條件具體如下。擴增曲線：95 ℃預(yù)變性20 s，95 ℃變性10 s，54 ℃退火34 s。溶解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。采用公式2-ΔΔCt計算基因相對表達(dá)量差異倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 菌株基本情況

經(jīng)16S rDNA擴增及序列分析顯示，實驗菌株均為紋帶棒狀桿菌。83株紋帶棒狀桿菌樣本來源及分布病區(qū)如表2、表3所示。

2.2 藥敏實驗

83株紋帶棒狀桿菌對12種抗生素的敏感性結(jié)果如表4所示。紋帶棒狀桿菌對萬古霉素、利奈唑胺100%敏感，對紅霉素(MIC50>16 μg/mL、MIC90>16 μg/mL)、環(huán)丙沙星(MIC50>32 μg/mL、MIC90>32 μg/mL)、克林霉素(MIC50>16 μg/mL、MIC90>16 μg/mL)均表現(xiàn)出完全耐藥，對青霉素、頭孢噻肟、美羅培南的耐藥率分別為97.6%、95.2%、92.8%，對四環(huán)素的耐藥率為86.7%，對慶大霉素的耐藥率為38.6%，對多西環(huán)素和利福平的耐藥率最低，分別為13.3%和6.0%。

表2 83株紋帶棒狀桿菌樣本來源

表3 83株紋帶棒狀桿菌病區(qū)分布

2.3 耐藥基因檢測

83株菌均檢測到喹諾酮類藥物耐藥基因(gyrA)；ermX基因的檢出率為100%；在四環(huán)素耐藥菌株中，tetW基因的檢出率為88%；在慶大霉素耐藥的菌株中，aph(3”)-Ⅰb基因的檢出率為36.1%、aph(6)-Ⅰd基因的檢出率為37.3%、aac(6’)-Ⅰb基因的檢出率為15.7%。具體結(jié)果如表5所示。

2.4 耐藥基因的相對表達(dá)量分析

熒光定量PCR結(jié)果表明，在不同濃度的紅霉素、四環(huán)素的作用下，ermX和tetW基因的相對表達(dá)量差異倍數(shù)結(jié)果如表6所示。ermX和tetW基因的相對表達(dá)量均有所變化，但變化不明顯。部分?jǐn)U增產(chǎn)物溶解曲線如圖1所示，候選基因的溶解曲線均為單峰，說明所設(shè)計的引物特異性良好。

表4 83株紋帶棒狀桿菌藥敏判定結(jié)果

表5 耐藥基因檢測結(jié)果(n=83)

表6 不同藥物濃度下ermX和tetW基因相對表達(dá)量差異倍數(shù)

A: secA; B: ermX; C: tetW.

3 討論

本研究從醫(yī)院臨床標(biāo)本中獲得了83株紋帶棒狀桿菌(Cs)，其中ICU病區(qū)的最多，占比48%(40株)；從痰液標(biāo)本中獲得了44株(53%)。Verroken 等[3]在進行流行病學(xué)分析時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在醫(yī)院發(fā)現(xiàn)1株新的紋帶棒狀桿菌時，至少會有1名患者被收入ICU病區(qū)或是呼吸道感染科室，而本研究中ICU病區(qū)有27例的臨床診斷是呼吸道感染，結(jié)果與文獻報道類似。本研究的菌株是否來自同一克隆群，進一步的分子流行病學(xué)分析將提供重要的線索。

藥物敏感性分析表明，83株紋帶棒狀桿菌均為多重耐藥菌株，而來自北京、廣東、河北唐山地區(qū)醫(yī)院的分離菌株的多重耐藥率分別為88.8%、100%、97.3%[8]。此外，重慶地區(qū)醫(yī)院分離菌株同樣表現(xiàn)出100%多重耐藥率[11]。本研究中的菌株對紅霉素、環(huán)丙沙星、克林霉素表現(xiàn)出完全耐藥，對萬古霉素、利奈唑胺表現(xiàn)出完全敏感，這與在河南地區(qū)某醫(yī)院分離的紋帶棒狀桿菌有相似的耐藥譜[12]，同樣的情況也出現(xiàn)在內(nèi)蒙古地區(qū)[13]。這和國外的情況亦類似[1, 3, 14-17]，例如：2010—2014年從日本醫(yī)院分離的24株紋帶棒狀桿菌對萬古霉素(MIC50為0.5 μg/mL、MIC90為 0.5 μg/mL)完全敏感，對喹諾酮類藥物(MIC50>16 μg/mL、MIC90>16 μg/mL)完全耐藥，對克林霉素(MIC50>8 μg/mL、MIC90>8 μg/mL)也表現(xiàn)出完全耐藥[1]；2011年1月—8月在美國倫敦醫(yī)院分離的24株紋帶棒狀桿菌也表現(xiàn)出了相似的耐藥譜，對紅霉素、克林霉素耐藥，對萬古霉素敏感[3]。

通常，雙歧桿菌和棒狀桿菌對紅霉素類耐藥是由菌株的染色體攜帶ermX基因所致[18]。本研究中對紅霉素和克林霉素耐藥的菌株均檢測到ermX基因，提示紋帶棒狀桿菌攜帶的核糖體甲基化酶基因使紅霉素作用靶點的核糖體蛋白甲基化，從而降低藥物作用，這是紋帶棒狀桿菌對紅霉素耐藥的潛在機制。50%MIC、25%MIC紅霉素作用濃度對ermX基因的表達(dá)無顯著影響，提示耐藥菌株對紅霉素的耐藥方式屬于內(nèi)在型耐藥[19-20]，無論誘導(dǎo)劑存在與否，核糖體甲基化酶基因(ermX)都可持續(xù)而穩(wěn)定的表達(dá)。

楊雪靜等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，紋帶棒狀桿菌對四環(huán)素的耐藥性主要與tet基因簇有關(guān)。本研究中除1株對四環(huán)素耐藥的菌株未檢測到tetW基因，其余耐藥菌株均擴增到了tetW基因。測序結(jié)果與耐藥質(zhì)粒Pja144188的tetW基因相似度為99%。研究發(fā)現(xiàn)，在50%MIC、25%MIC四環(huán)素濃度作用下，tetW基因的表達(dá)無顯著變化，推測tetW基因編碼核糖體保護蛋白繼而對四環(huán)素等產(chǎn)生耐藥性是一個穩(wěn)定表達(dá)的過程，并不會因為藥物是否存在而改變其表達(dá)。

本研究對山東地區(qū)分離的83株紋帶棒狀桿菌進行了藥物敏感性、耐藥機制檢測。結(jié)果顯示，該地區(qū)的紋帶棒狀桿菌有較廣的耐藥譜和耐藥基因攜帶率。這將為后續(xù)的紋帶棒狀桿菌耐藥流行病學(xué)研究及院內(nèi)感染防控提供參考，而對于紋帶棒狀桿菌的耐藥機制還須進一步研究。