劉立立，楊進(jìn)威，姜如云，姜玉梅，李永春，李磊

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院／河南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家小麥工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046）

MicroRNAs（miRNAs）是由21～24個(gè)核苷酸（nts）組成的具有重要調(diào)節(jié)功能的非編碼小RNA分子［1，2］。隨著近年來高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展改進(jìn)，越來越多的miRNAs被識(shí)別鑒定出來。研究表明，miRNAs不僅可以調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和生理過程，在逆境脅迫過程中也發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［3，4］。因此，探究miRNAs在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中的作用機(jī)制和逆境響應(yīng)機(jī)制對(duì)研究開發(fā)植物潛力有著重要意義。

大量研究發(fā)現(xiàn)，miR396在不同物種生長(zhǎng)發(fā)育與逆境脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮重要的作用。水稻中osa－miR396通過調(diào)節(jié)靶基因GRF對(duì)水稻產(chǎn)量以及籽粒大小產(chǎn)生影響［5］。大豆中g(shù)ma－miR396與GRF之間調(diào)控的穩(wěn)態(tài)關(guān)系對(duì)其根的生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)揮著重要作用［6］。在擬南芥中ath－miR396通過與其他miRNAs相互作用共同參與溫度、干旱等非生物脅迫過程［7］。在匍匐剪股穎中過表達(dá)osa－miR396c，結(jié)果引起剪股穎株型發(fā)生改變進(jìn)而提高植株對(duì)非生物脅迫的抗性［8］。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在棉花［9］、擬南芥［7］等植物中，miR168、miR171、miR396等miRNAs通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控來響應(yīng)溫度、干旱脅迫過程，這為miRNAs在極端溫度下的作用提供了新的認(rèn)識(shí)。然而目前在小麥中taemiR396介導(dǎo)的非生物應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制尚不明確。本研究著重分析tae－miR396b的染色體位置、序列特征、時(shí)空表達(dá)及其對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)模式，為明確tae－miR396b在小麥生長(zhǎng)發(fā)育及非生物脅迫響應(yīng)過程中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

小麥不同組織材料及處理：選取在大田條件下正常生長(zhǎng)的中國(guó)春（CS）、京841（J841）、豫麥18（YM18）、鄭麥004（ZM004）和矮抗58（AK58）成熟的種子和揚(yáng)花期的穗下節(jié)、旗葉、節(jié)間、節(jié)，于－80℃中保存?zhèn)溆?；選取籽粒飽滿的上述品種的干種子，利用1.5%的H2O2表面消毒10 min，用滅菌水清洗后，擺放于玻璃培養(yǎng)皿中在光照培養(yǎng)箱（光照強(qiáng)度為240 mmol·m－2·s－1，25℃條件下光照16 h，18℃下黑暗8 h）內(nèi)培養(yǎng)，待小麥長(zhǎng)到二葉一心時(shí)取根系和葉片，液氮速凍后于－80℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

高低溫脅迫材料及處理：選取豫麥18和京841飽滿種子，表面消毒后擺放入玻璃培養(yǎng)皿中，在光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待小麥長(zhǎng)到二葉一心時(shí)，將麥苗分別轉(zhuǎn)至4℃和42℃的恒溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行模擬高低溫脅迫處理；分別在處理0、0.5、1、2、6、12、24 h和48 h時(shí)取根系、葉片和莖尖組織，于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 生物信息學(xué)分析

利用miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／www.mirbase.org／）對(duì)不同物種miR396的信息進(jìn)行檢索；利用Ensembl Plants（http：／／plants.ensembl.org／Triticum_aestivum／Info／Index）數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)miR396的染色體進(jìn)行定位分析；利用RNA Folding Form（http：／／unafold.rna.albany.edu／？q＝mfold／rnafolding－form），對(duì)pre－miR396b序列的莖環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；利用Plant CARE（http：／／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／plantcare／html／），對(duì)miRNA上游區(qū)域中的啟動(dòng)子元件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。

1.3 RNA的提取和TaMIR396b片段克隆

組織材料的RNA提取按照TransZol試劑盒（全式金，北京）說明書操作進(jìn)行；籽粒材料的RNA提取按照TransZol Plant試劑盒（全式金，北京）說明書操作進(jìn)行。

RNA質(zhì)量檢測(cè)：將提取的總RNA利用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)其質(zhì)量，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其濃度，將檢測(cè)到的完整的RNA用于下一步反轉(zhuǎn)錄。

RNA的反轉(zhuǎn)錄：用于克隆TaMIR396b基因的cDNA，按照FastKing RT Kit With gDNase（天根，北京）的說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；用于tae－miR396b表達(dá)特性分析的cDNA的反轉(zhuǎn)錄，按照TransScript?miRNA First－Strand cDNA Synthesis Super-Mix試劑盒（全式金，北京）的說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。合成得到的cDNA于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

TaMIR396b片段克隆：以上述反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板，通過引物L(fēng)01和L02（表1）克隆TaMIR396b片段，對(duì)克隆得到產(chǎn)物進(jìn)行跑膠檢測(cè)，將目的片段切膠回收、連接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆，通過A、B基因組特異引物L(fēng)03、L04（表1）對(duì)重組克隆進(jìn)行鑒定，挑選與目的條帶大小一致的單克隆，送公司測(cè)序分析。

表1 RT－PCR及qRT－PCR引物

1.4 表達(dá)特性分析

以上述cDNA作為模板，U6作為內(nèi)參基因（表1），qRT－PCR體系及程序按照TransStart?Top Green qPCR SuperMix（全式金，北京）說明書進(jìn)行。qRT－PCR反應(yīng)程序（兩步法進(jìn)行）：預(yù)變性94℃2 min；變性94℃5 s；退火／延伸60℃10 s；熔解曲線：65～95℃（0.5℃／s，5 s）。反應(yīng)設(shè)置40個(gè)循環(huán)進(jìn)行。qRT－PCR 得到數(shù)據(jù)，通過2－△△Ct法計(jì)算，用Microsoft Excel作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 tae－miR396b序列特征分析

通過miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)獲得不同物種中miR396b的成熟序列，序列對(duì)比分析結(jié)果顯示，不同物種間成熟的miR396b序列高度一致（圖1A），因此該miRNA高度保守，推測(cè)其功能可能也具有保守性。利用 EnsemblPlants對(duì) taemiR396b的成熟序列進(jìn)行基因組對(duì)比分析，結(jié)果將tae-miR396b定位于第6號(hào)染色體的長(zhǎng)臂上；通過 NCBI（https：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）進(jìn)行TaMIR396b的3個(gè)部分同源基因序列對(duì)比分析，結(jié)果表明，3個(gè)同源基因部分一致性較高，與6AL序列相比，6BL和6DL的序列一致性分別為90%和95%，且3個(gè)同源基因間存在SNP和InDel差異（圖1B）。

通過PlantCARE 網(wǎng)站對(duì)TaMIR396b上游2 000 bp的區(qū)域進(jìn)行啟動(dòng)子預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明，上游啟動(dòng)子區(qū)域包含有TATA－box轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、MYB鹽脅迫啟動(dòng)子元件、MYC抗寒性啟動(dòng)子功能元件、水楊酸順式響應(yīng)元件、ABRE脫落酸響應(yīng)元件、ARE抗氧化調(diào)節(jié)元件、G－box和Sp1光響應(yīng)順式元件、CCGTCC－motif分生組織表達(dá)元件、LTR低溫響應(yīng)元件、GT1－motif光響應(yīng)元件、RY－element種子特異相關(guān)元件等多個(gè)調(diào)控元件（圖1C）。

圖1 TaMIR396b序列特征分析

2.2 TaMIR396b基因的克隆

通過設(shè)計(jì)引物L(fēng)01和L02從中國(guó)春、豫麥18和京841的cDNA中分別擴(kuò)增獲得TaMIR396b基因片段，長(zhǎng)度在192 bp左右（圖2A）。將克隆得到的TaMIR396b片段進(jìn)行回收測(cè)序，測(cè)序結(jié)果利用APE軟件進(jìn)行序列分析，結(jié)果（圖2B）顯示，3個(gè)品種間存在SNP和InDel差異，在第47、52、86、88、94、116個(gè)核苷酸位置處豫麥18和京841中分別存在1個(gè)SNP差異，在77、82個(gè)核苷酸位置處存在 InDel差異。將測(cè)序結(jié)果正確的TaMIR396b序列利用RNA Folding Form網(wǎng)站進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，結(jié)果（圖2C）表明A、B和D同源基因均能形成特定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。

圖2 TaMIR396b基因的克隆及序列特征分析

2.3 小麥tae－miR396b的組織表達(dá)特性

通過對(duì)tae－miR396b在5個(gè)品種不同組織中的表達(dá)模式分析（圖3）表明，tae－miR396b在不同組織中均有表達(dá)，但不同組織間的相對(duì)表達(dá)量存在較大差異，比如，節(jié)間中相對(duì)表達(dá)量均較高，旗葉中相對(duì)表達(dá)量均較低。tae－miR396b在5個(gè)品種間相對(duì)表達(dá)量也存在差異，在種子和穗下節(jié)中差異較大。在京841和矮抗58的節(jié)間、穗下節(jié)和節(jié)中，tae－miR396b的相對(duì)表達(dá)量顯著高于豫麥18、鄭麥004和中國(guó)春；在京841和矮抗58的成熟種子中，tae－miR396b的相對(duì)表達(dá)量顯著低于豫麥18、鄭麥004和中國(guó)春。taemiR396b的相對(duì)表達(dá)量在不同品種間表達(dá)存在較大差異，可能與品種發(fā)育特性相關(guān)?？傮w來看，tae－miR396b在5個(gè)品種的不同組織中相對(duì)表達(dá)量均存在差異，推測(cè)tae－miR396b在小麥生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮調(diào)控作用。

圖3 tae－miR396b的組織表達(dá)特性分析

2.4 小麥tae－miR396b對(duì)高低溫脅迫的響應(yīng)

在4℃低溫脅迫下（圖4A、4B和4C），taemiR396b在豫麥18和京841中均表現(xiàn)出受低溫脅迫誘導(dǎo)先上調(diào)表達(dá)而后下調(diào)表達(dá)的變化趨勢(shì)，但兩個(gè)品種不同器官間tae－miR396b的表達(dá)水平和動(dòng)態(tài)趨勢(shì)存在較大差異。豫麥18和京841葉片中（圖4A），tae－miR396b在脅迫后表達(dá)迅速上調(diào)，1 h時(shí)達(dá)到峰值，后下調(diào)表達(dá)，兩品種均出現(xiàn)上調(diào)下降波動(dòng)。與京841相比，taemiR396b在豫麥18中的表達(dá)變化幅度較大，整體來看，豫麥18葉片中該miRNA對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)要比京841更快，這可能與豫麥18具有弱春性有關(guān)。豫麥18莖尖中（圖4B），tae－miR396b受脅迫1 h后出現(xiàn)快速表達(dá)上調(diào)，2 h時(shí)達(dá)到峰值，后表達(dá)下調(diào)；而京841莖尖中，tae－miRNA則整體表現(xiàn)先緩慢上調(diào)表達(dá)，12 h達(dá)到最高，然后表達(dá)下調(diào)。根系中（圖4C），京 841的 taemiR396b在脅迫2 h后快速上調(diào)表達(dá)，6 h時(shí)達(dá)到峰值，而后迅速下調(diào)表達(dá)；而在豫麥18中先迅速上調(diào)表達(dá)，并且分別在0.5 h和6 h出現(xiàn)表達(dá)峰值，而后表達(dá)下調(diào)。該miRNA在葉片、莖尖和根系中表現(xiàn)出相似的表達(dá)模式，推測(cè)tae－miR396b在小麥低溫脅迫過程中發(fā)揮著一定的作用。

42℃高溫脅迫下，豫麥18和京841葉片中tae－miR396b的表達(dá)水平出現(xiàn)先短暫下調(diào)表達(dá)然后上調(diào)表達(dá)而后下調(diào)表達(dá)的變化趨勢(shì)，24 h后，豫麥18的tae－miR396b表達(dá)趨于平穩(wěn)，而京841又快速上調(diào)表達(dá)（圖4D）。兩品種莖尖中（圖4E），tae－miR396b在豫麥18中整體表現(xiàn)為受高溫脅迫先表達(dá)上調(diào)，0.5 h達(dá)到峰值而后下調(diào)表達(dá)，變化趨勢(shì)趨于平穩(wěn)；京841中，tae－miR396b表達(dá)變化趨勢(shì)較大，出現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)表達(dá)然后上調(diào)后下調(diào)再上調(diào)表達(dá)的變化趨勢(shì)，與豫麥18相比，京841中該miRNA對(duì)高溫脅迫處理的響應(yīng)更加強(qiáng)烈。京841和豫麥18的根系中（圖4F），taemiR396b呈現(xiàn)不同的表達(dá)變化趨勢(shì)：京841中，tae－miR396b呈現(xiàn)下調(diào)－上調(diào)－下調(diào)－上調(diào)－下調(diào)表達(dá)的變化趨勢(shì)，在1 h和6 h出現(xiàn)表達(dá)峰值；豫麥18中，tae－miR396b的表達(dá)整體呈現(xiàn)出下調(diào)的變化趨勢(shì)，與豫麥18相比京841具有更高的表達(dá)水平。高溫脅迫下，tae－miR396b在兩個(gè)品種小麥根系中表達(dá)模式差異較大，推測(cè)這可能與兩個(gè)品種的春冬性有一定的關(guān)系；在葉片和莖尖中整體表達(dá)趨勢(shì)相似，證明該miRNA在小麥高溫脅迫過程中發(fā)揮著一定的作用。

圖4 tae－miR396b在高低溫脅迫過程中的表達(dá)模式

3 討論與結(jié)論

隨著第一個(gè)miRNA 在秀麗線蟲中被發(fā)現(xiàn)［10］，越來越多的miRNAs被發(fā)現(xiàn)。miRNAs通過剪切［11－13］、翻譯抑制［14，15］或DNA甲基化［16，17］三種方式調(diào)控靶基因進(jìn)而對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育及在逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮調(diào)控作用。在匍匐剪股草中過表達(dá)miR396改變?nèi)~片大小進(jìn)而提高植株對(duì)逆境的適應(yīng)性［8］；水稻中miR396通過調(diào)節(jié)水稻的株型以及籽粒大小進(jìn)而對(duì)產(chǎn)量產(chǎn)生影響［18］等?；趯?shí)驗(yàn)室前期基礎(chǔ)研究，發(fā)現(xiàn)miR396b在小麥的生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用［19］。本研究結(jié)果表明，tae－miR396b基因在小麥不同組織部位均有表達(dá)，且在節(jié)間相對(duì)表達(dá)量較高，說明該基因廣泛參與了小麥各組織的發(fā)育過程。通過對(duì)tae－miR396b基因上游調(diào)控區(qū)域啟動(dòng)子預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域存在著一些與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的調(diào)控元件，如CCGTCC－motif分生組織表達(dá)元件、TCA水楊酸響應(yīng)順式元件和RY－element種子特異相關(guān)元件等多個(gè)調(diào)控元件，這些啟動(dòng)子元件可能是影響tae－miR396b在不同組織中存在差異表達(dá)的重要因素。

miRNAs在植物中的作用涉及到生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝調(diào)控等各個(gè)方面，包括種子萌發(fā)［20］、活性氧清除［21］、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［22］、植物器官形態(tài)發(fā)育［23］以及逆境脅迫應(yīng)答［24］等。研究表明，miR1432、miR444、miR319 響應(yīng)植物的低鉀脅迫［25］；miR1139在調(diào)節(jié)小麥對(duì)Pi缺乏的耐受性中起關(guān)鍵作用［26］；miR167則參與小麥的發(fā)育和抗?jié)B透脅迫［27］。此外，近來的研究表明，miR396參與包括溫度［9，8］、鹽［7，28］和干旱［29］等多種非生物脅迫響應(yīng)的調(diào)控。本研究結(jié)果表明，tae－miR396b對(duì)高低溫逆境脅迫均有響應(yīng)，在根系、莖尖和葉片中表現(xiàn)出不同的響應(yīng)模式，這可能與溫控脅迫的信號(hào)通路有關(guān)。通過tae－miR396b基因上游調(diào)控區(qū)域啟動(dòng)子預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域存在著與脅迫響應(yīng)相關(guān)的調(diào)控元件，如MYB鹽脅迫啟動(dòng)子元件、MYC抗寒性啟動(dòng)子功能元件、ARE抗氧化調(diào)節(jié)元件、脫落酸響應(yīng)元件（ABRE和A－box）、光響應(yīng)元件（G－box、Sp1、AE－box和GT1－motif）、溫度響應(yīng)元件（MYC和LTR）等，這些調(diào)控元件可能是影響tae－miR396b參與逆境脅迫響應(yīng)的調(diào)控因子。

綜上，miRNAs在小麥生長(zhǎng)發(fā)育過程和非生物脅迫響應(yīng)過程中存在調(diào)節(jié)作用。本研究克隆了不同小麥品種中的tae－miR396b基因，并對(duì)其在不同品種中的組織表達(dá)特性以及對(duì)高低溫脅迫的應(yīng)激響應(yīng)進(jìn)行了分析。下一步將繼續(xù)對(duì)taemiR396b進(jìn)行生物學(xué)功能分析，為完善小麥非生物脅迫響應(yīng)生理機(jī)制和分子機(jī)制提供必要的理論依據(jù)，確定tae－miR396b調(diào)控的下游靶基因，并進(jìn)行功能分析和試驗(yàn)驗(yàn)證，闡明其內(nèi)在的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。