郭月琴 李帆 姜程曦 任仙櫻

摘要 [目的]通過(guò)試驗(yàn)尋找出優(yōu)良的溫郁金脫毒苗的制備方法及栽培方法。[方法]通過(guò)固定其中一個(gè)條件不變，改變其他因素，驗(yàn)證出較好的溫郁金根狀莖消毒方法，及其叢生芽的誘導(dǎo)、愈傷、繼代、分化、生根培養(yǎng)方法。[結(jié)果]溫郁金根狀莖的消毒方法為流水沖洗30～50 min，再用70%乙醇和10%過(guò)氧化氫先后消毒20～40 s和6～8 min，然后用無(wú)菌水重新沖洗3～4次。叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L，愈傷、繼代、分化、生根培養(yǎng)基分別為MS+2，4-D 2.0 mg/L+KT 5.0 mg/L、MS+2，4-D 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L、MS+KT 5.0 mg/L + NAA 0.3 mg/L、MS+NAA 1.0 mg/L。[結(jié)論]通過(guò)對(duì)脫毒苗制備過(guò)程的條件控制，使溫郁金脫毒苗品質(zhì)較高以及脫毒率可以達(dá)到100%，另外提供科學(xué)的栽培方法，使所制備的脫毒苗栽培育苗后成活率達(dá)到100%，且幼苗健壯。

關(guān)鍵詞 溫郁金;脫毒苗;制備方法;移栽方法

中圖分類號(hào) S 567.23+9? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）16-0040-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.16.012?? 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on the Rapid Propagation and Transplanting Methods of Virus-free Seedling of ?Curcuma wenyujin

GUO Yue-qin1，2，LI Fan2，JIANG Cheng-xi1，3 et al （1.College of Pharmaceutical Sciences， Wenzhou Medical University，Wenzhou，Zhejiang 325035;2.Institute of Life Sciences，Wenzhou University，Wenzhou，Zhejiang 325035;3.Wenzhou Ejin Pharmaceutical Co.，Ltd.，Yueqing，Zhejiang 325600）

Abstract [Objective]The preparation method and cultivation method of excellent ?Curcuma wenyujin ?virus-free seedlings were found through experiments.[Method]By fixing one of the conditions unchanged and changing other factors， a better disinfection method of ?Curcuma wenyujin ?rhizomes， and the induction， callus， subculture， differentiation， and rooting culture methods of cluster buds were verified.[Result]The disinfection method of ?Curcuma wenyujin ?rhizoma tympanum was to flush the rhizoma tympanum by running water for 30-50 minutes， then disinfect it with 70% ethanol and 10% hydrogen peroxide for 20-40 s and 6-8 minutes successively， and then rinse it again with sterile water for 3-4 times.The cluster bud induction medium was MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L.The media for callus， subculture， differentiation and rooting were MS+2，4-D 2.0 mg/L+KT 5.0 mg/L， MS+2，4-D 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L， MS +KT 5.0 mg/L + NAA 0.3 mg/L， MS+NAA 1.0 mg/L.[Conclusion]By controlling the conditions in the preparation process of virus-free seedlings， the quality of ?Curcuma wenyujin ?virus-free seedlings is higher and the virus-free rate can reach 100%，and by providing scientific cultivation methods， the survival rate of the prepared virus-free seedlings after cultivation and nursery can reach 100%， and the seedlings are robust.

Key words ?Curcuma wenyujin; Virus-free seedlings;Preparation method;Transplanting method

溫郁金 （Curcuma wenyujin） 系浙江南部地區(qū)種植的一種姜科姜黃屬植物，其塊根、根莖可供藥用，塊根加工成的藥材溫郁金是浙江省著名道地藥材“浙八味”之一[1]。目前，溫郁金的野生種已罕見(jiàn)，以人工栽培為主。溫郁金喜溫暖濕潤(rùn)、陽(yáng)光充足的氣候，耐旱抗?jié)?，但怕霜凍，適宜在土質(zhì)疏松、排水良好、土層深厚的沖積土、砂壤土中生長(zhǎng)[2-5]。溫郁金開(kāi)花很少，種子多不充實(shí)，栽培上用種姜根莖繁殖。溫郁金年生長(zhǎng)周期約250 d，一般4月上旬（清明前后）種植，12月中上旬收獲[6]。

隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，土壤污染日益嚴(yán)重，尤其是土壤中有害重金屬積累到一定程度就會(huì)對(duì)土壤-植物系統(tǒng)產(chǎn)生毒害，不僅導(dǎo)致土壤退化，還會(huì)引起農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)降低，危及人類生命和健康。溫郁金在環(huán)境因子的作用下，植物與病原菌相互適應(yīng)和相互斗爭(zhēng)導(dǎo)致病害的發(fā)生和蔓延。由于溫郁金屬于多基源品種，來(lái)源復(fù)雜，并且目前溫郁金的種植基本上是按照傳統(tǒng)的粗放模式進(jìn)行，導(dǎo)致品種退化、病毒化嚴(yán)重、采收及產(chǎn)地加工不規(guī)范等情況出現(xiàn)[7]，致使藥材質(zhì)量不穩(wěn)定，難以得到控制，進(jìn)而影響產(chǎn)品質(zhì)量，市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力下降，市場(chǎng)占有份額擴(kuò)展困難。

近年來(lái)，脫毒苗的研究與使用能夠在一定程度上緩解上述問(wèn)題。趙霞等[8]通過(guò)對(duì)草莓莖尖進(jìn)行熱處理脫毒處理，得到的草莓苗繁育增殖、病蟲(chóng)害減少，降低了生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，提高了經(jīng)濟(jì)效益。吳順等[9]以無(wú)花丹參莖尖為材料，優(yōu)化其脫毒培養(yǎng)和植株再生的激素濃度組合，篩選出最佳組合，所得的無(wú)花丹參苗移栽后病蟲(chóng)害減少且長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良。肖雅等[10]以感染TMV和CMV的湘西本地小黃姜為試材，采用熱處理、莖尖培養(yǎng)結(jié)合添加病毒唑的方法進(jìn)行脫毒處理以獲得無(wú)病毒的優(yōu)質(zhì)生姜種苗，其脫毒率可達(dá)100%。

該試驗(yàn)為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，經(jīng)過(guò)多年試驗(yàn)，研制出一種溫郁金煉苗方法及移栽方法，為溫郁金組培苗生產(chǎn)者提供技術(shù)參考，同時(shí)為溫郁金GAP生產(chǎn)提供新的規(guī)范化種植模式。

1 材料與方法

1.1 材料 該試驗(yàn)所用的溫郁金頂芽或腋芽尖來(lái)自浙江溫州市瑞安沙洲村溫郁金種植基地，并由溫州醫(yī)科大學(xué)姜程曦教授鑒定，共100批次。

1.2 試劑與儀器

MS培養(yǎng)基，KT、6-BA、2，4-D、NAA激素，均來(lái)自北京酷來(lái)搏科技有限公司;光照培養(yǎng)箱LI180A、恒溫培養(yǎng)箱來(lái)自上海京孚儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 芽的脫毒。

秋天收獲時(shí)，挑選株高在70～120 cm的矮稈品種溫郁金，取溫郁金根狀莖上的0.5～2.0 cm的頂芽或腋芽尖端作為接種材料，并對(duì)其進(jìn)行消毒處理，每種處理接種50個(gè)。試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)處理。處理①，流水沖洗10～15 min，用70%乙醇和10%過(guò)氧化氫先后消毒10～15 s和3～5 min，無(wú)菌水沖洗3～4次;處理②，流水沖洗30～50 min，再用70%乙醇和10%過(guò)氧化氫先后消毒20～40 s和6～8 min，然后用無(wú)菌水重新沖洗3～4次;處理③，流水沖洗10～15 min，再用70%乙醇和10%過(guò)氧化氫先后消毒20～40 s和6～8 min，然后用無(wú)菌水重新沖洗3～4次;處理④，流水沖洗10～15 min，70%乙醇溶液消毒10～15 s，無(wú)菌水沖洗3～4次;處理⑤，流水沖洗10～15 min， 10%過(guò)氧化氫先后消毒3～5 min，無(wú)菌水沖洗3～4次。

脫毒率=脫毒個(gè)數(shù)/成活個(gè)數(shù)×100%（1）

1.3.2 根狀莖頂芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)。

在無(wú)菌條件下，取莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)，切成0.1～0.3 mm方塊接種在MS含有6-BA和NAA不同濃度配比的莖尖啟動(dòng)培養(yǎng)基上，每處理接種50個(gè)，在無(wú)光照和溫度為12～18 ℃的條件下培養(yǎng)2～5 d，然后在溫度為18～24 ℃，每天光照為4～6 h的條件下培養(yǎng)15～20 d，觀察莖尖誘導(dǎo)率。

誘導(dǎo)率=成活數(shù)/接種數(shù)×100%（2）

1.3.3 愈傷組織的誘導(dǎo)。

將小芽轉(zhuǎn)接至含有不同激素2，4-D和KT配比的MS培養(yǎng)基中，在28 ℃進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，觀察愈傷組織的形成情況，每處理接種50個(gè)。

1.3.4 繼代培養(yǎng)。

形成愈傷組織后轉(zhuǎn)接至含有不同激素2，4-D和KT配比的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況，每處理接種50個(gè)。

繼代培養(yǎng)成活率=繼代培養(yǎng)成活數(shù)/接種數(shù)×100%（3）

1.3.5 轉(zhuǎn)接分化。繼代培養(yǎng)之后轉(zhuǎn)接至含有不同激素NAA和KT配比的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行分化，觀察分化情況，每處理接種50個(gè)。

分化率=分化數(shù)/接種數(shù)×100%（4）

1.3.6 生根。分化后轉(zhuǎn)接至以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加至6-BA、2，4-D、NAA和KT的培養(yǎng)基中進(jìn)行生根，觀察生根情況。

生根率=生根數(shù)/接種數(shù)×100%（5）

1.3.7 移栽。

在日平均溫度為20～30 ℃時(shí)進(jìn)行移栽。研究不同基質(zhì)、不同基質(zhì)消毒方式和不同肥料對(duì)溫郁金育苗的影響，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的溫郁金脫毒苗，采用正交試驗(yàn)的方法（表1）進(jìn)行試驗(yàn)，每50株作為一個(gè)處理。

基質(zhì)的原料有椰糠、表土、河沙。A1.椰糠;A2.椰糠∶表土=1∶1;A3.椰糠∶表土∶河沙=1∶1∶1。

基質(zhì)消毒法使用3種方法：B1.活性炭消毒法，是指將椰子殼燒成灰，灑在基質(zhì)表面;B2.雷公藤根粉+細(xì)土或草木灰消毒法，為該試驗(yàn)原創(chuàng)法，雷公藤的根粉碎成的細(xì)粉使用量為每株苗用2.5～3.0 g，細(xì)土或草木灰5.0～6.5 g;B3.多菌靈消毒法，每株苗施50%多菌靈可濕性粉劑0.015 g。

使用3種肥料：C1.農(nóng)家肥;C2.秸稈肥;C3.腐熟的菜籽餅、提取莪術(shù)油后產(chǎn)生的藥渣以質(zhì)量比為20～30∶1搗碎混合。3種肥料都是每株苗1.5～3.0 g通過(guò)穴施方法施肥。

采用“+”針對(duì)成活率、病蟲(chóng)害、生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，5個(gè)“+”最優(yōu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方法對(duì)溫郁金莖頂芽（腋芽）培養(yǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明（表2），各種處理對(duì)接種材料都能起到良好的消毒作用，但不同消毒方法的脫毒率與莖尖成活率之間存在差異，其中處理②與處理③的脫毒率較高，但是處理③的成活率最低，處理②的成活率也是最高，適于溫郁金莖尖培養(yǎng)。

2.2 不同濃度激素配比對(duì)溫郁金頂芽（腋芽）誘導(dǎo)率的影響 從表3可以看出，隨著6-BA濃度的升高，誘導(dǎo)率逐漸升高后基本持平，且以3.0 mg/L為好;隨著NAA濃度的升高，誘導(dǎo)率逐漸升高后基本持平，且以1.0 mg/L為好。所以溫郁金莖尖誘導(dǎo)最佳的激素為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L。

2.3 不同濃度激素配比對(duì)溫郁金頂芽（腋芽）愈傷組織的影響

從表4可以看出，隨著2，4-D 濃度的升高，生成的愈傷組織個(gè)數(shù)逐漸升高后基本持平，且以2.0 mg/L為好;隨著KT濃度的升高，生成的愈傷組織個(gè)數(shù)逐漸升高，且以5.0 mg/L為好。所以溫郁金頂芽（腋芽）愈傷組織的最佳激素配比為MS+2，4-D 2.0 mg/L+KT 5.0 mg/L。

2.4 不同濃度激素配比對(duì)溫郁金頂芽（腋芽）繼代培養(yǎng)的影響

從表5可以看出，隨著2，4-D 濃度的升高，繼代培養(yǎng)成活率逐漸升高后開(kāi)始下降，且以1.0 mg/L為好;隨著KT濃度的升高，成活率逐漸升高后有所下降，且以0.5 mg/L為好。所以溫郁金頂芽（腋芽）繼代培養(yǎng)的最佳激素配比為MS+2，4-D 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L。

2.5 不同濃度激素配比對(duì)溫郁金頂芽（腋芽）分化的影響

從表6可以看出，隨著NAA 濃度的升高，分化率逐漸升高后開(kāi)始下降;隨著KT濃度的升高，分化率逐漸升高后基本持平。綜合考慮，以NAA 0.3 mg/L+KT 5.0 mg/L為好。所以溫郁金頂芽（腋芽）分化培養(yǎng)的最佳激素配比為MS+KT 5.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L。

2.6 不同激素配比對(duì)溫郁金頂芽（腋芽）分化后生根的影響

從表7可以看出，添加NAA激素的培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根率最高，為97.3%;添加6-BA激素的培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根率最低，為86.0%;最高最低相差11.3%。所以，添加NAA 1.0 mg/L激素的培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根為最適培養(yǎng)基。

2.7 移栽 試驗(yàn)結(jié)果顯示（表8），任何含有A3、B2、C3因素的栽培方式都可以起到促進(jìn)溫郁金脫毒苗的生長(zhǎng)，以A3B2C3為組合的移栽方式最優(yōu)，為“+++++”，幼苗成活率為最高（98.91%），病蟲(chóng)害相比傳統(tǒng)栽培方法[11]最高能降低84%，生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)較傳統(tǒng)脫毒苗[12]也更為良好。

3 結(jié)論與討論

該試驗(yàn)以溫郁金根狀莖頂芽（腋芽）為材料，參考前人的研究[13-14]，尋找一種更合適溫郁金脫毒苗的制法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，消毒方法為用流水沖洗溫郁金頂芽（腋芽）30～50 min，再用70%乙醇和10%過(guò)氧化氫先后消毒20～40 s和6～8 min，然后用無(wú)菌水重新沖洗3～4次，可以達(dá)到100%的脫毒率;脫毒后以MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以MS+2，4-D 2.0 mg/L+KT 5.0 mg/L為愈傷組織培養(yǎng)基，以MS+2，4-D 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，以MS+KT 5.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L培養(yǎng)基進(jìn)行分化，以MS+NAA 1.0 mg/L培養(yǎng)基進(jìn)行生根，得到脫毒試管苗成活率能達(dá)到100%。

另外，該試驗(yàn)參考前人的方法[5，15]在溫郁金脫毒苗的移栽方法中創(chuàng)新了對(duì)基質(zhì)的消毒方法和肥料的應(yīng)用，即采用雷公藤的根粉碎成的細(xì)粉加草木灰對(duì)土壤進(jìn)行消毒，選用腐熟的菜籽餅、提取莪術(shù)油后產(chǎn)生的藥渣作為肥料。

植物經(jīng)過(guò)幾代種植，品質(zhì)一般都出現(xiàn)不同程度的退化，使得植物成活率不高，生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)不好，而導(dǎo)致這一現(xiàn)象的主要原因是植物病毒的感染。為克服這一問(wèn)題，獲得高產(chǎn)，脫毒苗在植物的種植上得到廣泛應(yīng)用。該試驗(yàn)在傳統(tǒng)溫郁金脫毒苗制備的方法上[12]，結(jié)合了其他的方法，尋找到一種更適合溫郁金脫毒苗制備的方法，在后續(xù)過(guò)程中，能培育出成活率更高的苗。

溫郁金是一種藥用價(jià)值極高的藥材，其含有的β-欖香烯[16]更是在抗癌方面表現(xiàn)出了很大的潛力。所以，尋找出一條能夠快速高效獲得溫郁金資源的途徑非常有必要。該試驗(yàn)為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，經(jīng)過(guò)多年試驗(yàn)，研制出一種溫郁金脫毒苗的制備方法及移栽方法，為溫郁金脫毒苗生產(chǎn)者提供技術(shù)參考，同時(shí)也為溫郁金GAP生產(chǎn)提供新的規(guī)范化種植模式。

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