肖曉燕 馮果,2△ 李瑋,2 許琴 周志容 黃僑宗 任晨晨 彭禮珍

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.國家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550025)

京尼平苷酸為環(huán)烯醚萜類化合物，在車前子、杜仲中含量較高，為杜仲中主要有效活性成分之一。研究[1-4]表明京尼平苷酸具有保肝利膽、修復(fù)損傷脊髓、提高記憶力、抗炎等多種生物活性。京尼平苷酸為京尼平苷一相代謝產(chǎn)物，兩者結(jié)構(gòu)相似，前者有抗炎活性[5]。目前，京尼平苷酸的研究集中在含量測定、提取純化、生物活性方面，而對其在大鼠體內(nèi)的組織、血漿分布研究尚有欠缺。因此，本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-MS/MS，初步探討口服給藥后，京尼平苷酸在大鼠各組織的分布情況，為京尼平苷酸的臨床應(yīng)用、劑型研制提供參考，同時(shí)也為其他中藥(京尼平苷酸為主要活性成分)的研究提供參考意義。

1 材料與方法

1.1儀器與藥品試劑及動(dòng)物 儀器：超高壓液相質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)Waters Quattro Premier XE/Acquity UPLC(沃特世公司)，質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)API 4000 Qtrap，(購于美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，包含有ESI和APCI接口離子源，2臺(tái)島津LC-20AD泵，Analyst Software 1.5.2色譜工作站，SIL-20AC恒溫自動(dòng)進(jìn)樣器，CBM-20A控制器，CTO-20A柱溫箱)，LT1002E電子天平(常熟市天量儀器有限責(zé)任公司)，DS113T超聲波清洗機(jī)(天津市富城達(dá)科技有限公司)、JA2003電子分析天秤(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)、H1650臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，50Hz)。藥品與試劑：京尼平苷酸(Geniposidic acid，北京博易匯科生物技術(shù)有限公司，批號：27741-01-1，純度>98%)，新綠原酸(博易匯科生物有限公司，批號：170304，純度>98%)，色譜純甲醇(Fisher公司，批號：180920)，色譜純乙腈(Fisher公司，批號：187255)，甲酸(北京邁瑞達(dá)科技有限公司，批號：185326)，二甲基亞砜(DMSO，美國Tedia公司，批號：20180911)，肝素鈉(天津生物化學(xué)制藥有限公司，批號：201805)，生理鹽水(貴州天地有限公司，批號：A18091203)，其他試劑均為分析純。動(dòng)物：SPF級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量(200±20)g，購于湖南長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，合格證號SCXK(湘)2018-0011。大鼠于室內(nèi)保持12 h光照，12 h避光循環(huán)飼養(yǎng)，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水，控制室內(nèi)溫度(25.0±1.0)℃，相對濕度(50.0±10.0)%。

1.2方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 京尼平苷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取京尼平苷酸對照品適量，少量DMSO溶解后，甲醇/水(20：80)配制成濃度為1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，臨用時(shí)稀釋，于4℃儲(chǔ)存。內(nèi)標(biāo)溶液的配制：取新綠原酸對照品適量，少量DMSO溶解后，甲醇/水(20：80)配制成濃度為100 μg/L的溶液，于4℃儲(chǔ)存。

1.2.2樣品預(yù)處理 組織勻漿液的制備：取各組織樣品加液氮研磨，加入3倍組織重量的生理鹽水，渦旋混勻，制得組織勻漿液。組織樣品的處理：移取組織勻漿液50 μL，加入5 μL甲醇溶液，加入200 μL甲醇/乙腈(1：1)溶液，渦旋混合2 min，8 000 r/min，離心15 min，取10 μL上清液，用UPLC-MS/MS進(jìn)行測定。

1.2.3檢測條件 色譜條件：Phexnomonex F5色譜柱(3.0 mm×50 mm，2.6 μm)，流動(dòng)相：0.1%FA水(A)-0.1%FA乙腈(B)，梯度洗脫(0～0.50 min，10%B；0.50～2.00 min，60%B；2.00～2.10 min，90%B；2.10～3.50 min，90%B；3.50～3.60 min，10%B；3.60～5.00 min，10%～0%B)，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量3 μL，進(jìn)樣器溫度4℃，柱溫為室溫。質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子模式，離子源參數(shù)霧化電壓IS為-4 500.00/+5 500，輔助加熱器GS2為60.0，離子源溫度TEM設(shè)定600.0℃，氣簾氣CUR為30.0，霧化氣GS1為50.0，掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測模式(MRM)，檢測離子對為京尼平苷酸m/z 373.0→123.1，新綠原酸m/z 353.2 → 179.0，碰撞能量分別為57，-24eV。

1.3方法學(xué)考察

1.3.1專屬性試驗(yàn) 取空白組織液50 μL，加入適量京尼平苷酸和150 μL內(nèi)標(biāo)溶液，按1.2.2方法處理，在上述檢測條件下，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾京尼平苷酸及新綠原酸的測定， UPLC-MS/MS譜圖見圖1。

注：A.空白胃組織勻漿液；B.空白胃組織勻漿液+京尼平苷酸；C.空白胃組織勻漿液+內(nèi)標(biāo)。圖1 大鼠胃組織勻漿液 UPLC-MS/MS圖

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限 取空白組織液50 μL，加入適量京尼平苷酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液、150 μL內(nèi)標(biāo)溶液，按1.2.2方法處理，配成濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100、150 μg/L組織樣品。在上述檢測條件下，記錄峰面積，以京尼平苷酸、濃度(C，μg/L)為橫坐標(biāo)，京尼平苷酸面積和新綠原酸峰內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(As/Ai)為縱坐標(biāo)，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。表明京尼平苷酸在濃度0.1～150 μg/L線性關(guān)系良好，定量下限為0.1 μg/L。

表1 京尼平苷酸在不同組織中的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)(μg/L)

1.3.3精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取空白組織液50 μL，加入京尼平苷酸溶液適量、150 μL內(nèi)標(biāo)溶液，按1.2.2方法處理，配成濃度為0.2、20、100 μg/L組織樣品，分別在1 d內(nèi)和連續(xù)3 d內(nèi)進(jìn)樣測定。京尼平苷酸各組織液樣品的日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度的RSD和相對誤差(RE)結(jié)果見表2。表明京尼平苷酸在不同組織中，精密度和準(zhǔn)確度均符合要求。

表2 京尼平苷酸在不同組織中的精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

1.3.4提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 提取回收率：配制三個(gè)濃度為0.2、20、100 μg/L組織液樣品，每種濃度6份用UPLC-MS/MS進(jìn)行測定，記錄京尼平苷酸的峰面積A1；取空白組織液50 μL，加入京尼平苷酸溶液適量、150 μL內(nèi)標(biāo)溶液，按1.2.2方法處理，配成濃度為0.2、20、100 μg/L組織樣品，記錄峰面積A2；計(jì)算組織液中峰面積和不經(jīng)任何處理峰面積的比值A(chǔ)2/A1，即為提取回收率。組織液基質(zhì)效應(yīng)：取不同濃度的京尼平苷酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入內(nèi)標(biāo)溶液，配制濃度為0.2、20、100 μg/L組織樣品，記錄峰面積A3，將已處理空白組織液配制的標(biāo)準(zhǔn)品溶液峰面積A2與相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品直接進(jìn)樣的峰面積A3比較，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明京尼平苷酸在不同組織中的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)均符合要求。見表3。

表3 京尼平苷酸在不同組織中的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

1.3.5穩(wěn)定性試驗(yàn) 取空白組織液50 μL，加入京尼平苷酸溶液適量、150 μL內(nèi)標(biāo)溶液，按1.2.2方法處理，配成濃度為0.2、20、100 μg/L樣品，分別于24 h，1、7、14 d解凍，-20℃冰箱中保存14 d，考察其穩(wěn)定性，結(jié)果京尼平苷酸24 h內(nèi)、反復(fù)凍融三次、-20℃冰箱中保存14 d相對穩(wěn)定，RSD均小于10.0%。另外，取20 μg/L的質(zhì)控樣品，分別用空各組織液稀釋20倍，每組6份，每份濃度為1 μg/L，測定結(jié)果表明稀釋倍數(shù)實(shí)驗(yàn)的精密度的RSD及相對誤差均在10%以內(nèi)，符合生物樣品分析方法要求。見表4。

表4 京尼平苷酸在不同組織中的穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.4組織分布實(shí)驗(yàn) 灌胃液的配制：精密稱取京尼平苷酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，用生理鹽水溶解并定容，配成濃度為3.0 mg/mL的水溶液。組織樣品的采集：健康SD大鼠10只，體質(zhì)量(200±20)g，隨機(jī)分為3組，每組3只，1只作為空白組，取空白組織；給藥前12 h禁食不禁水，灌胃給藥后(60 mg/kg)，分別在0.5、1.5、3 h腹腔注射3%的戊巴比妥鈉(2 ml/kg)麻醉大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血后，分別取大鼠的心、肝、脾、肺、腎、胃等組織，用4℃生理鹽水沖洗干凈，用濾紙吸干，稱重，于—80℃下保存?zhèn)溆?。組織樣品的處理按1.2.2方法處理。各組織濃度的計(jì)算：各組織中京尼平苷酸的濃度采用以下公式[10]計(jì)算：Ct=CsVs/P，其中，Ct代表組織濃度(μg/g)，Cs代表組織液濃度(μg/L)，Vs代表組織液的體積，P代表組織的質(zhì)量。

2 結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，京尼平苷酸在不同組織中分布差異較大。給藥0.5 h后，各組織中京尼平苷酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)排序?yàn)槲?腎>心>脾>肺>肝；給藥1.5 h后各組織的質(zhì)量分?jǐn)?shù)排序?yàn)槲?心>腎>肺>脾>肝；給藥3.0 h后各組織的質(zhì)量分?jǐn)?shù)排序?yàn)樾?胃>脾>腎>肺，肝組織測不到濃度。見表5。

表5 京尼平苷酸在大鼠不同組織中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-MS/MS，研究口服給藥后，京尼平苷酸在大鼠各組織的分布情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明口服給藥后，京尼平苷酸主要分布在胃和腎組織。京尼平苷酸在不同組織的分布速度有差異，在肝、脾、腎組織中0.5 h達(dá)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大值，肺、心、胃在1.5 h達(dá)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大值。說明京尼平苷酸在肝、脾、腎組織分布速度較快，在0.5 h能達(dá)到達(dá)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大值，隨著時(shí)間的延長，肝、脾、腎組織中濃度逐漸降低，3.0 h后肝組織未檢測到藥物的存在；而肺、心、胃組織中藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1.5 h達(dá)到最大值后也逐漸降低，但胃組織中下降的速度較其它組織快。京尼平苷酸極性大，易溶于親水性溶劑，難溶于親脂性溶劑，研究表明，極性較大的化合物難以透過血—腦屏障到達(dá)腦部發(fā)揮作用。由于藥物在體內(nèi)分布復(fù)雜、易受其它因素影響，本實(shí)驗(yàn)初步探討口服給藥后，京尼平苷酸在大鼠心、肝、脾、肺、腎、胃幾個(gè)重要組織中的分布情況，存在一定的局限性。后續(xù)將從不同給藥途徑、京尼平苷酸理化性質(zhì)、藥理作用等方面，進(jìn)行藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究，以闡明其在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化和代謝情況，為其臨床應(yīng)用及劑型深入開發(fā)提供參考。