賈曉麗，祝敏，趙三虎

（忻州師范學(xué)院 化學(xué)系，山西 忻州 034000）

0 引言

沙棘是胡頹子科沙棘屬植物，廣泛分布于華北、東北、西北及西南等地［1］，沙棘葉中豐富的黃酮類化合物具有抗氧化、抗腫瘤以及預(yù)防心血管疾病等功效［2］。近年來(lái)，對(duì)沙棘葉總黃酮的提取方法不斷有文獻(xiàn)報(bào)道［3］，史豆豆等將蔗糖酯作為表面活性劑用于沙棘葉黃酮的提取，獲得了1.6%的黃酮提取率［4］；趙二勞等將表面活性劑椰子油脂肪酸二乙醇酰胺用于微波輔助提取沙棘葉總黃酮，比僅用微波法提取沙棘葉黃酮的提取率提高了43.8%［5］；孟曉等通過(guò)先水提后醇提的兩次溶劑提取方法提取沙棘葉總黃酮，在最優(yōu)條件下，總黃酮得率為8.04%［6］；陳春等利用復(fù)合酶結(jié)合超聲法提取沙棘葉總黃酮，獲得了1.78%的提取率［7］；趙芙蓉等利用超聲、微波雙輔助法提取沙棘葉黃酮，在最佳工藝條件下，測(cè)得沙棘葉總黃酮含量為42.75 mg/g［8］。在以上沙棘葉黃酮的提取方法中，乙醇是主要用溶劑。雖然用水做溶劑浸提黃酮類化合物存在綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)該是最理想的溶劑，但由于其極性大，容易把糖類、蛋白質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽等極性大易溶于水的成分提取出來(lái)［9］。所以單一溶劑的使用，受其極性的限制，往往很難滿足特定組分的提取，因此，探索一種極性合適、綠色環(huán)保的多元復(fù)合溶劑用于沙棘黃酮的提取將是一項(xiàng)非常有意義的工作。離子液體，因其良好的熱穩(wěn)定性、低蒸氣壓以及對(duì)無(wú)機(jī)、有機(jī)物良好的溶解能力，不斷被應(yīng)用于合成化學(xué)［10］、藥學(xué)［11］及材料化學(xué)等領(lǐng)域［12］。最近研究發(fā)現(xiàn)，離子液體通過(guò)加快細(xì)胞壁的破壞，對(duì)纖維素顯示出強(qiáng)的溶解能力，進(jìn)而促進(jìn)天然產(chǎn)物活性成分的溶出，在天然產(chǎn)物活性成分提取方面表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［13］?；趯?duì)離子液體研究的基礎(chǔ)［14-15］及對(duì)沙棘研究的興趣，課題組早期將吡啶類離子液體用于沙棘葉總黃酮提取，發(fā)現(xiàn)離子液體可有效提取沙棘葉總黃酮［16］。為進(jìn)一步探究離子液體種類對(duì)沙棘葉總黃酮提取率的影響以及多元復(fù)合溶劑的提取性能，8 種季磷離子液體被合成，并將其與含水乙醇組合形成三元復(fù)合溶劑，被用于沙棘葉總黃酮的提取。在微波輔助作用下，三元復(fù)合溶劑，因其極性可調(diào)，表現(xiàn)出優(yōu)異的提取能力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器、試劑與材料

723 型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；XH-200A 微波固液相合成/萃取儀（北京祥鵠科技發(fā)展有限公司）；400MHz 核磁共振儀（Bruker公司）。

沙棘葉采自山西省偏關(guān)縣趙家溝村（野生中華沙棘，采于2017 年6 月），經(jīng)炒青陰干，粉碎、過(guò)40 目篩備用；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），三丁基膦（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%），鹵代烴（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，分析純）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 季膦離子液體的合成

參照文獻(xiàn)［17］，在N2保護(hù)及磁力攪拌下，于250 mL 三頸圓底燒瓶中加入50 mL（0.20 mol）三丁基膦，然后用恒壓滴液漏斗將0.24 mol 鹵代烴滴加到圓底燒瓶，滴加結(jié)束后，緩緩升溫至微微回流狀態(tài)。待反應(yīng)24 h 后，將反應(yīng)液自然冷卻至室溫，用30 mL 環(huán)己烷洗滌3 次后真空干燥，幾乎以定量的產(chǎn)率得到8 種季膦離子液體（正丁基三丁基溴化膦，正辛基三丁基溴化膦，正癸基三丁基溴化膦，十二烷基三丁基溴化膦，十四烷基三丁基溴化膦，溴化-2-羥乙基三丁基膦，氯化-2-羥乙基三丁基膦）（圖1），產(chǎn)物經(jīng)熔點(diǎn)測(cè)定及NMR 表征，為目標(biāo)產(chǎn)物。

圖1 季膦離子液體的合成Fig.1 Synthesis of phosphonium ionic liquids

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考文獻(xiàn)［18］的方法，準(zhǔn)確稱量20.0 mg 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用無(wú)水乙醇將其溶解并定容至100 mL容量瓶，配成0.20 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取0.0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL比色管中，然后加入0.5 mL 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%亞硝酸鈉溶液，搖勻靜置5 min，再加入0.5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的硝酸鋁溶液，搖勻靜置5 min，最后加入3.0 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%氫氧化鈉溶液，用無(wú)水乙醇定容至100 mL，靜置16 min，在510 nm 處測(cè)吸光度。以吸光度值y為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度x為橫坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。得標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2 Standard curve of rutin

y=11.336 9x-0.005 88，R2=0.999 54。

1.2.3 黃酮含量及提取率的測(cè)定

參考文獻(xiàn)［19］方法，移取0.5 mL 沙棘葉黃酮提取液于10 mL 比色管中，按1.2.2 中方法測(cè)定黃酮含量，按照下式計(jì)算黃酮提取率：

提取率（%）=C×f×V/m×100%，

式中C：樣品中黃酮濃度，mg·mL-1；f：稀釋倍數(shù)；V：樣品體積，mL；m：樣品質(zhì)量，g。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

1.2.4.1 離子液體種類的選擇

固定微波功率325 W、微波時(shí)間6 min、按照料液比1：20（g·mL-1）量取炒青陰干的沙棘葉粉末1.0 g、三元復(fù)合溶劑20 mL 用于提取，探究沙棘葉黃酮提取率與離子液體種類的關(guān)系。其中三元復(fù)合溶劑按照離子液體濃度0.20 mol·L-1，由離子液體加體積分?jǐn)?shù)60%乙醇配制而成。所用離子液體分別是乙基三丁基溴化膦（A）、正丁基三丁基溴化膦（B）、正辛基三丁基溴化膦（C）、正癸基三丁基溴化膦（D）、十二烷基三丁基溴化膦（E）、十四烷基三丁基溴化膦（F）、溴化-2-羥乙基三丁基膦（G）和氯化-2-羥乙基三丁基膦（H）。

1.2.4.2 微波功率的選擇

取炒青陰干的沙棘葉粉末1.0 g、按料液比1：20（g·mL-1）取三元復(fù)合溶劑20 mL（由離子液體十二烷基三丁基溴化膦與60%乙醇配制的濃度為0.20 mol·L-1的包含離子液體、水及乙醇的三組分體系）、微波時(shí)間6 min、微波功率分別設(shè)置為195 W、260 W、325 W、390 W、455 W，探究沙棘葉總黃酮提取率與微波功率之間的關(guān)系。

1.2.4.3 微波時(shí)間的選擇

取炒青陰干的沙棘葉粉末1.0 g，按料液比1：20（g·mL-1）取三元復(fù)合溶劑20 mL（由離子液體十二烷基三丁基溴化膦與60%乙醇配制的濃度為0.20 mol·L-1的包含離子液體、水及乙醇的三組分體系）、固定微波功率325 W，設(shè)置微波時(shí)間2 min、4 min、6 min、8 min、10 min，探究沙棘葉總黃酮提取率與微波時(shí)間之間的關(guān)系。

1.2.4.4 乙醇濃度的選擇

固定微波功率325 W，微波時(shí)間6 min，炒青陰干的沙棘葉粉末1.0 g，按料液比1：20（g·mL-1）取三元復(fù)合溶劑20 mL（由離子液體十二烷基三丁基溴化膦與不同濃度含水乙醇配制的濃度為0.20 mol·L-1的包含離子液體、水及乙醇的三組分體系），當(dāng)含水乙醇濃度為20%、40%、60%、80%、100%時(shí)，探究沙棘葉總黃酮提取率與乙醇濃度之間的關(guān)系。

1.2.4.5 料液比的選擇

固定微波功率325 W，微波時(shí)間6 min，取炒青陰干的沙棘葉粉末1.0 g，依據(jù)料液比1：15、1：20、1：25、1：30、1：35（g·mL-1）分別取三元復(fù)合溶劑（由離子液體十二烷基三丁基溴化膦與60%乙醇配制的濃度為0.20 mol·L-1的包含離子液體、水及乙醇的三組分體系）15 mL、20 mL、25 mL、30 mL、35 mL 用于沙棘葉總黃酮的提取，探究提取率與料液比之間的關(guān)系。

1.2.4.6 離子液體溶液濃度的選擇

固定微波功率325 W、微波時(shí)間6 min，取炒青陰干的沙棘葉粉末1.0 g，按料液比1：20（g·mL-1）取三元復(fù)合溶劑（由離子液體十二烷基三丁基溴化膦與60%乙醇配制的不同濃度的包含離子液體、水及乙醇的三組分體系）20 mL。為了比較季膦離子液體與吡啶離子液體對(duì)沙棘總黃酮的提取效果，參照文獻(xiàn)［16］設(shè)置離子液體濃度為0.2 mol·L-1、0.4 mol·L-1、0.6 mol·L-1、0.8 mol·L-1、1.0 mol·L-1，探究沙棘葉總黃酮提取率和離子液體濃度之間的關(guān)系。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化沙棘葉總黃酮提取工藝

在Box-Benhnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理的基礎(chǔ)上，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以沙棘葉總黃酮提取率（Y）為響應(yīng)值，利用Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)單因素實(shí)測(cè)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，優(yōu)化提取工藝。通過(guò)最高提取率和最低提取率的差值比較，最終確定以微波時(shí)間（A）、乙醇濃度（B）、液料比（C）、離子液體濃度（D）為自變量，以沙棘葉總黃酮含量（Y）為響應(yīng)值，利用Design Expert 8.0.6 軟件設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)（表1）。

表1 響應(yīng)面法試驗(yàn)的因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface method experiments

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 離子液體種類對(duì)沙棘葉黃酮提取率的影響

將8 種季膦離子液體用于沙棘葉總黃酮的提取，如圖3 所示，隨著離子液體烷基鏈的增長(zhǎng)，提取率逐漸提高，當(dāng)離子液體烷基鏈?zhǔn)?2 個(gè)碳的十二烷基時(shí)，提取率達(dá)到最高，烷基鏈進(jìn)一步增長(zhǎng)提取率下降。相同碳鏈的離子液體溴化2-羥乙基三丁基膦和乙基三丁基溴化膦相比，提取率只是稍微提高，羥基的氫鍵作用表現(xiàn)得很微弱。陰離子不同的氯化2-羥乙基三丁基膦作為提取劑時(shí)的提取率略高于溴化2-羥乙基三丁基膦，進(jìn)一步說(shuō)明離子液體的極性是影響提取率的重要原因，三元復(fù)合溶劑的提取效果仍然遵從相似相溶原理。通過(guò)不同離子液體提取率的比較，離子液體為十二烷基三丁基溴化膦時(shí)，沙棘葉總黃酮提取率最高。

圖3 不同離子液體對(duì)沙棘葉黃酮提取率的影響Fig. 3 Effect of ionic liquids on the extraction rate of flavonoids from seabuckthorn leaves

2.1.2 微波功率對(duì)沙棘葉黃酮提取率的影響

微波對(duì)生物大分子高級(jí)結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵如氫鍵、范德華力等具有一定的破壞作用。由圖4 可知，沙棘葉總黃酮提取率隨微波功率的增加先增后減，當(dāng)微波功率為325 W 時(shí)，黃酮提取率達(dá)到最高。這可能是因?yàn)槲⒉üβ蔬^(guò)大，促使原料中部分有效成分發(fā)生降解或變性，導(dǎo)致溶劑中總黃酮含量降低，進(jìn)而影響沙棘葉總黃酮的提取［8］，且功率過(guò)高時(shí)，會(huì)增加能耗，增大成本，故最佳微波功率選擇325 W。

圖4 微波功率對(duì)沙棘葉黃酮提取率的影響Fig. 4 Effect of microwave power on the yield of flavonoids from seabuckthorn leaves

2.1.3 微波時(shí)間

由圖5 可知，沙棘葉中總黃酮提取率隨微波時(shí)間的增加而先增大后減小，當(dāng)微波時(shí)間為4 min 時(shí)，沙棘葉中總黃酮提取率達(dá)到最高，當(dāng)微波時(shí)間為6 min 時(shí)，黃酮提取率下降，原因可能是當(dāng)微波時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，會(huì)使部分黃酮化合物發(fā)生分解，使沙棘葉總黃酮提取率下降［8］。故最佳微波時(shí)間選擇4 min。

圖5 微波時(shí)間對(duì)沙棘葉黃酮提取率的影響Fig. 5 Effect of microwave time on the yield of flavonoids from seabuckthorn leaves

2.1.4 乙醇濃度

選用含水乙醇與離子液體組成的三元復(fù)合溶劑作為提取劑提取沙棘葉總黃酮，由圖6 可知，隨著乙醇濃度的升高，提取率先增加后減小，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時(shí)，沙棘葉中總黃酮提取率達(dá)到最高。這可能是因?yàn)槿獜?fù)合溶劑中乙醇含量低對(duì)黃酮類化合物的溶解性比較差，導(dǎo)致沙棘葉總黃酮溶出不完全，提取率低；但當(dāng)乙醇含量太高時(shí)，三元復(fù)合溶劑極性改變明顯，不利于黃酮的溶出，使黃酮提取率下降。所以選取80%乙醇配制離子液體、水及乙醇組合的三元復(fù)合溶劑，提取效果最佳。

圖6 乙醇濃度對(duì)沙棘葉黃酮提取率的影響Fig. 6 Effect of ethanol concentration on the yield of flavonoids from seabuckthorn leaves

2.1.5 料液比

由圖7 可知，當(dāng)沙棘葉與三元復(fù)合溶劑的料液比為1：30（g·mL-1）時(shí)，沙棘葉中總黃酮提取率達(dá)到最高，當(dāng)料液比大于1：30（g·mL-1）后，隨著料液比的增加，沙棘葉中總黃酮提取率緩慢減少。其原因可能是料液比為1：30（g·mL-1）時(shí)，溶劑中的沙棘葉已得到足夠的浸潤(rùn)，再增加溶劑，不僅使微波能量分散，而且雜質(zhì)溶出增多，導(dǎo)致沙棘葉總黃酮提取率下降［8］。因此，選擇1：30（g·mL-1）的料液比為最佳料液比。

圖7 料液比對(duì)沙棘葉黃酮提取率的影響Fig. 7 Effect of the ratio of solid to liquid on the yield of flavonoids from seabuckthorn leaves

2.1.6 離子液體濃度的影響

由圖8 可知，三元復(fù)合溶劑中溴化十二烷三丁基膦濃度逐漸增加時(shí)，沙棘葉黃酮提取率先增后降。當(dāng)離子液體濃度為0.80 mol·L-1時(shí)，沙棘葉中黃酮提取率最高。繼續(xù)增加離子液體濃度，沙棘葉中總黃酮提取率逐漸降低。原因可能為離子液體濃度大時(shí)，使得沙棘葉黃酮提取液黏稠度增大，不利于溶質(zhì)傳質(zhì)，致使沙棘葉中總黃酮提取率下降。因此選擇離子液體濃度為0.80 mol·L-1的三元復(fù)合溶劑作為提取劑。

圖8 離子液體濃度對(duì)沙棘葉黃酮提取率的影響Fig. 8 Effect of the ionic liquid concentration on the yield of flavonoids from seabuckthorn leaves

2.2 響應(yīng)面結(jié)果與分析

通過(guò)Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到回歸方程為Y=8.24－0.19A+0.011B－0.022C + 0.035D + 0.032AB－0.13AC +0.34AD+0.070BC+0.15BD+5.0×10-3CD－0.44A2－0.62B2－0.49C2－0.28D2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface test

根據(jù)相應(yīng)的試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)，然后對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到包含一次項(xiàng)、二次項(xiàng)、交互項(xiàng)的二次方程，并分析每個(gè)因素的交互效應(yīng)和主效應(yīng)，最終在一定水平范圍內(nèi)求出最佳值，結(jié)果見(jiàn)表3。依據(jù)表3 數(shù)據(jù)，參考文獻(xiàn)［20-21］的方法進(jìn)行分析，可知該回歸方程極顯著（F=26.68，P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（F=0.091 0，P＞0.05），即建立的模型有意義。A、AD、A2、B2、C2、D2均呈極顯著影響（P＜0.01），回歸系數(shù)R2為0.963 9，表明該模型相關(guān)度良好；校正決定系數(shù)R2adj為0.927 7，表明模型擬合度較為理想，實(shí)際測(cè)值與預(yù)測(cè)值能較好的契合，誤差小。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

2.2.1 響應(yīng)面的分析與優(yōu)化

響應(yīng)面能夠直觀地顯示出因素與因素之間的交互作用。固定微波時(shí)間（A）、含水乙醇濃度（B）、料液比（C）、離子液體濃度（D）中一個(gè)因素，探究余下三個(gè)因素對(duì)沙棘葉中總黃酮的交互作用影響，結(jié)果如圖9－14 所示。

圖9 微波時(shí)間和乙醇濃度對(duì)沙棘葉總黃酮提取率的影響Fig. 9 Effect of microwave time and ethanol concentration on the yield of flavonoids from seabuckthorn leaves

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)回歸模型，通過(guò)Design Expert 8.0.6 軟件分析，沙棘葉總黃酮最佳提取條件為微波時(shí)間3.5 min、乙醇濃度為80%、料液比為1：30（g·mL-1）、離子液體濃度為0.78 mol·L-1，此條件下預(yù)測(cè)沙棘葉中總黃酮得率為8.26%。為驗(yàn)證響應(yīng)面法的準(zhǔn)確性，在微波時(shí)間3.5 min、乙醇濃度為80%、料液比為1：30（g·mL-1）、離子液體濃度為0.78 mol·L-1的條件下進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，得平均吸光度為0.456 A，沙棘葉總黃酮的平均得率為8.11%。實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值相差僅0.15%，說(shuō)明該響應(yīng)面法得出的最佳提取工藝適用于沙棘葉總黃酮的提取。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)探究了微波輔助三元復(fù)合溶劑提取沙棘葉總黃酮的工藝條件，研究顯示：各因素對(duì)沙棘葉總黃酮提取率影響的大小順序?yàn)椋何⒉〞r(shí)間＞離子液體濃度＞料液比＞含水乙醇濃度。通過(guò)單因素分析并結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化得出沙棘葉總黃酮最佳提取條件為：微波時(shí)間3.5 min、離子液體為溴化十二烷三丁基膦且離子液體濃度為0.78mol·L-1、配制三元復(fù)合溶劑的含水乙醇濃度為80%、料液比為1：30（g·mL-1）。在該條件下，沙棘葉總黃酮的提取率達(dá)到了8.11%，高于傳統(tǒng)溶劑乙醇的提取率1.258 2%［22］，也高于吡啶類離子液體的提取率3.65%［16］，通過(guò)調(diào)控多元復(fù)合溶劑各組分比例，有效調(diào)節(jié)復(fù)合溶劑的極性、黏稠度，進(jìn)一步提升溶劑對(duì)纖維素的溶解能力、細(xì)胞的破壁能力及傳質(zhì)能力，高效促進(jìn)生物活性成分的析出。在微波輻射與三元復(fù)合溶劑的雙重作用下，沙棘葉總黃酮溶出速度快、提取時(shí)間短、提取率高，為沙棘葉總黃酮的提取提供了一種比較新穎的方法。

圖10 料液比和微波時(shí)間對(duì)沙棘葉總黃酮提取率的影響Fig. 10 Effect of microwave time and the ratio of solid to liquid on the yield of flavonoids from seabuckthorn leaves

圖11 微波時(shí)間和離子液體濃度對(duì)沙棘葉總黃酮提取率的影響Fig. 11 Effect of microwave time and ionic liquid concentration on the yield of flavonoids from seabuckthorn leaves

圖12 料液比和乙醇濃度對(duì)沙棘葉總黃酮提取率的影響Fig. 12 Effect of ethanol concentration and the ratio of solid to liquid on the yield of flavonoids from seabuckthorn leaves

圖13 離子液體濃度和乙醇濃度對(duì)沙棘葉總黃酮提取率的影響Fig. 13 Effect of ionic liquid concentration and ethanol concentration on the yield of flavonoids from seabuckthorn leaves

圖14 料液比和離子液體濃度對(duì)沙棘葉總黃酮提取率的影響Fig. 14 Effect of the ratio of solid to liquid and ionic liquid concentration on the yield of flavonoids from seabuckthorn leaves