聶志強(qiáng)，席鏡慧，楊秀清

（山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所，化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006）

0 引言

紡織印染、造紙、化妝品等行業(yè)對合成染料的使用需求連年遞增，其中約有10%～20%的染料隨廢水排放［1］。合成染料種類繁多，包括偶氮染料、噻嗪類染料、三苯甲烷染料、蒽醌染料、二苯乙烯染料等，其中偶氮染料產(chǎn)量最大，約占合成染料的70%［2］。這些染料多含有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，較難降解，且具有致癌、致突變等毒性。在國家倡導(dǎo)“生態(tài)優(yōu)先、綠色發(fā)展”的政策導(dǎo)向下，染料廢水無害處理是環(huán)境保護(hù)首要解決的重點(diǎn)問題。

國內(nèi)外處理偶氮染料廢水的方法主要有生物法、物理法、化學(xué)法等，其中生物法比物理和化學(xué)方法更具優(yōu)勢?？山到馊玖系奈⑸镉屑?xì)菌和真菌，主要包括生物吸附、酶催化降解等方式。多數(shù)真菌的脫色機(jī)制一般為生物吸附，但是白腐真菌不同，它主要通過胞外分泌一些酶類來降解染料。這些酶包括錳過氧化物酶（manganese peroxidase，MnP）、漆酶（laccase，Lac）、木素過氧化物酶（lignin peroxidase，LiP）等，具有非特異性、無須底物誘導(dǎo)、效率高、反應(yīng)條件溫和［3］等優(yōu)點(diǎn)。MnP 屬于氧化還原酶類，分子內(nèi)部包含一個血紅素輔基，對多種合成染料具有廣譜降解能力。近年來研究人員利用白腐菌產(chǎn)錳過氧化物酶對多種合成染料進(jìn)行脫色取 得 了 一 系 列 成 果。例 如，Zhang 等［4］從Cerrena unicolorBBP6 中提取純化的MnP 對多種染料（剛果紅、甲基橙、溴酚藍(lán)、結(jié)晶紫等）具有明顯的脫色效果，其中對結(jié)晶紫的脫色率可達(dá)80.9%，并且在牛仔布漂白方面也有很好的表現(xiàn)。李慧星［5］研究發(fā)現(xiàn)黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）的MnP 氧化脫色靛藍(lán)6 h 靛藍(lán)脫色率可達(dá)90.18%。一種海洋來源的擔(dān)子菌（Peniophorasp. CBMAI 1063）經(jīng)過7 d 處理后對紡織染料活性黑的脫色率達(dá)94%［6］。有研究利用一種新菌株L-25 分泌的MnP 可高效脫色12 種不同的偶氮和蒽醌類染料，脫色率在84.9%～99.6%之間［7］。平菇（Pleurotus ostreatus）分泌的MnP 在pH 4.0 的條件下，對多 種苯酚磺酞類染料進(jìn)行脫色，結(jié)果表明染料結(jié)構(gòu)對脫色率有顯著影響［8］。

前期研究篩選到一株白腐菌栓菌Trametessp.SQ01，其分泌的MnP 對三苯甲烷類染料具有較強(qiáng)的脫色能力［9］。本文旨在通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計進(jìn)一步研究并優(yōu)化白腐菌SQ01 錳過氧化物酶對偶氮染料的脫色條件。在此基礎(chǔ)上對天青A 染色的棉織布進(jìn)行漂白，進(jìn)一步拓展MnP 在染料廢水生物脫色領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 材料

1.1 菌株及產(chǎn)酶條件

栓菌Trametessp. SQ01 由本實(shí)驗(yàn)室篩選并保存，采用PDA 培養(yǎng)基［10］培養(yǎng)，菌株產(chǎn)酶體系及產(chǎn)酶培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)［11］。

1.2 主要試劑和儀器

偶氮染料固藍(lán)RR、橙黃G、氨基黑10B、剛果紅以及噻嗪染料天青A 購自生工生物工程股份有限公司，均為分析純。

Eppendorf 5424 臺 式 離 心 機(jī)、日 立UV-2010 紫外分光光度計、BS-2F 數(shù)碼振蕩培養(yǎng)箱、pH 計、恒溫培養(yǎng)箱。

2 方法

2.1 MnP的分離純化及酶活測定

經(jīng)2 次丙酮沉淀和DEAE-52 柱層析法純化［11］MnP。以每分鐘生成1 μmol Mn3+所需的酶量定義為一個酶活單位（U），酶活測定方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行［11］。

2.2 染料脫色體系及脫色率

脫色體系包括酒石酸鈉緩沖液（pH 4.5 20 mmol/L），MnSO4（1 mmol/L），H2O2（0.1 mmol/L）和不同濃度的染料和MnP，以上均為終濃度。偶氮染料的脫色率通過紫外-可見分光光度計測量脫色前后最大吸收波長吸光度值來計算。

脫色率（?）計算公式為：

其中，A0為脫色反應(yīng)前溶液的吸光值，At為脫色反應(yīng)后溶液的吸光值。實(shí)驗(yàn)設(shè)3 個平行樣品，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

為研究影響MnP 脫色偶氮染料的因素，分別以溫度、pH 值、染料濃度、酶濃度及脫色時間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，各因素水平見表1。

表1 單因素實(shí)驗(yàn)水平表Table 1 Level table of single factor experiments

2.3.2 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取溫度、pH、染料濃度和酶濃度4 個主要因素，每個因素選3 個水平，參照文獻(xiàn)［12-14］進(jìn)行Box-Benhnken 組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計，響應(yīng)面設(shè)計因素水平見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計因素水平表Table 2 Factors and level value of response surface methodology

2.4 MnP對天青A染色棉織布的漂白應(yīng)用

棉織布染色前需要先進(jìn)行漂白以去除棉坯布表面的漿料和雜質(zhì)，然后洗凈、晾干、裁成方塊狀，使用1 g/L 的天青A 染料進(jìn)行染色，并不斷攪拌以保持染色均勻［15］。將染色好的棉織布置于20 mL脫色體系中，脫色條件除時間外采用響應(yīng)面優(yōu)化后的數(shù)值，對照除不添加酶外處理方式相同。每隔20 min 記錄最大吸收波長475 nm 的OD 值。已測得染料濃度（x，g/L）與OD475（y）之間呈線性關(guān)系，即y=3.963 2x+0.079 2。因此通過測定脫色體系中染料濃度的變化來反映漂白效果（?）。

定義計算公式為：?=（ct-c0）/1×100%。即溶液中染料濃度越高，對棉織布漂白效果越好。其中，c0為脫色反應(yīng)前溶液的染料濃度，ct為脫色反應(yīng)后溶液中的染料濃度。

實(shí)驗(yàn)設(shè)3 個平行樣品，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

響應(yīng)面分析使用軟件Design Expert 12.0，數(shù)據(jù)處理分析及制圖使用軟件Origin 2018。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 MnP脫色偶氮染料的單因素實(shí)驗(yàn)

溫度、pH 值、染料濃度、酶濃度、脫色時間因素對偶氮染料生物脫色的影響見圖1。

溫度對偶氮染料的脫色情況如圖1A 所示。在30°C～50°C 范圍內(nèi)，脫色率隨著溫度的升高逐漸增 大。40 °C ～50 °C 脫 色 最 佳，固 藍(lán)RR 鹽、橙 黃G、剛果紅、氨基黑10B 脫色率分別為84.1%、46.6%、43.3%、41.5%。

pH 對偶氮染料的脫色情況如圖1B 所示。在pH 3～7 范圍內(nèi)，脫色率呈先上升后下降的趨勢。pH 4.5 時，脫色效果最佳，固藍(lán)RR 鹽、橙黃G、氨基黑10B、剛果紅的脫色率分別為82.2%、45.6%、41.5%、42.9%。

染料濃度對偶氮染料的脫色情況如圖1C 所示，當(dāng)染料濃度較低為20 mg/L～100 mg/L 時，脫色率最佳。隨著染料濃度的繼續(xù)增加，脫色率開始降低。當(dāng)染料濃度大于100 mg/L 時，脫色率呈現(xiàn)不可逆的下降。由此可以得出來源于Trametessp.SQ01 的MnP 最高耐受染料濃度為100 mg/L，且較低的染料濃度更加利于脫色的進(jìn)行。

酶濃度對偶氮染料的脫色情況如圖1D 所示。在MnP 濃度100 U/L～400 U/L 范圍內(nèi)，脫色率隨著酶濃度的升高逐漸增加。當(dāng)酶濃度達(dá)到400 U/L時，固藍(lán)RR 鹽、橙黃G、氨基黑10B、剛果紅的脫色率分別達(dá)到79.2%，42.6%，38.5%，40.9%。在400～600 U/L 范圍內(nèi)繼續(xù)增加酶濃度，脫色率增幅減小，因此認(rèn)為400 U/L 為MnP 的最適脫色酶濃度。

脫色時間對MnP 的脫色效果的影響見圖1E。固藍(lán)RR 鹽在2 h～4 h 時脫色率明顯增加，4 h 時脫色率達(dá)到79.2%，4 h～24 h 脫色率增幅很小，可見4 h 為固藍(lán)RR 鹽的最適脫色時間。在2 h～24 h 范圍內(nèi)，隨著時間的延長，橙黃G、氨基黑10B、剛果紅的脫色率有所增加但是增幅較小，表明這三種染料較難脫色且延長時間對提高脫色率作用不明顯。因此選擇2 h 作為這三種染料的最適脫色時間。

圖1 MnP 脫色偶氮染料單因素實(shí)驗(yàn)Fig.1 Single factor experiments of decolorizing azo dyes by MnP

3.2 Box-Benhnken響應(yīng)面法優(yōu)化

響應(yīng)面Box-Benhnken 組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計的29 組實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，脫色率均在57.5%以上。對表3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)擬合，得到脫色率（ω）對溫度、pH 值、染料濃度、酶濃度的二次多項(xiàng)回歸方程為：ω = 83.12－1.59A+0.40B－3.58C+5.56D－2.38AB+1.95AD+1.23BD－1.45CD－5.61A2－1.99B2－6.99C2－9.58D2對該回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4 與表5?；貧w方程模型的P值＜0.000 1，說明回歸方程描述各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系時，其因變量與全體自變量之間的線性關(guān)系是極顯著的，即這種實(shí)驗(yàn)方法是可靠的。模型一次項(xiàng)A、C、D 差異極顯著，B 差異不顯著；交互項(xiàng)AB 差異極顯著，AD、CD 差異顯著，其他交互項(xiàng)差異不顯著；二次項(xiàng)差異均極顯著，說明所選因素與響應(yīng)值之間不是簡單的線性關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)測得的信噪比為26.95，在合理范圍之內(nèi)。變異系數(shù)為1.84%，低于10%，說明實(shí)驗(yàn)的可信度和模型精確度較高。模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.965 8＞0.8，說明該模型能較好地描述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以解釋約96.58%的實(shí)驗(yàn)中脫色率的變化。綜合以上分析，本次擬合質(zhì)量較高且模型的精確度高，可用于分析和預(yù)測MnP 脫色偶氮染料固藍(lán)RR 鹽的各因素水平的優(yōu)化。

表3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of response surface optimization experiment

表4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 4 Analysis of variance of the response surface experi‐ment results

表5 二次回歸方程的方差分析Table 5 Analysis of variance of the quadratic model

為了解實(shí)驗(yàn)因素對于脫色率的影響情況以及因素兩兩間對于脫色率的交互影響，本實(shí)驗(yàn)選定4個主要因素，優(yōu)化可以得到每兩個因素交互的6 個響應(yīng)曲面圖，選取其中有代表性的3 個，如圖2－圖4，當(dāng)其中一個因素的值固定，另一個因素使響應(yīng)值呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，即每個因素都在它的實(shí)驗(yàn)水平范圍內(nèi)有最佳值。圖2－圖4 呈現(xiàn)的曲面擬合度較高，有明顯的最高點(diǎn)，表明兩因素交互影響大，即酶濃度與溫度、酶濃度與pH、酶濃度與染料濃度之間的交互作用顯著。各因素對響應(yīng)值影響程度的排序是：酶濃度＞染料濃度＞溫度＞pH。

圖2 酶濃度和溫度對脫色率的交互作用Fig.2 Interaction of enzyme concentration and temperature on decolorization rate

圖3 酶濃度和pH 對脫色率的交互作用Fig.3 Interaction of enzyme concentration and pH value on decolorization rate

圖4 酶濃度和染料濃度對脫色率的交互作用Fig.4 Interaction of enzyme concentration and pH value on decolorization rate

通過Design Expert 軟件在建立的回歸方程和二次曲面模型基礎(chǔ)上進(jìn)行工藝優(yōu)化得到MnP 脫色染料的最佳條件：溫度49.26°C，pH 值為4.64，染料濃度為85.54 mg/L，酶濃度為431.32 U/L，脫色4 h 后脫色率達(dá)到84.68%。檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，同時考慮到實(shí)際操作和實(shí)驗(yàn)儀器的局限性，修正后的工藝條件為：溫度為49 °C，pH 值為4.6，染料濃度為85.5 mg/L，酶濃度為430 U/L。在此條件下進(jìn)行了3 次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，脫色率的平均值為84.5%，與理論值基本吻合，說明實(shí)驗(yàn)設(shè)計和響應(yīng)面法優(yōu)化得到的降解脫色工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

3.3 MnP對天青A染色棉織布的漂白脫色應(yīng)用

在MnP 生物脫色條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，研究了MnP 對噻嗪染料即天青A 染料染色棉織布的漂白脫色應(yīng)用，結(jié)果見圖5。由圖5 可知，在0～2 h 范圍內(nèi)，MnP 對染色棉織布的脫色率逐步升高，2 h 脫色率達(dá)到16%，2 h～15 h 內(nèi)脫色率增加不明顯。

圖5 錳過氧化物酶對天青A 染色棉織布的脫色Fig. 5 Decolorization of azure A dyed cotton fabric by manganese peroxidase

4 分析與討論

單因素實(shí)驗(yàn)表明Tramatessp. SQ01 MnP 在40 °C～50 °C 范 圍 內(nèi) 表 現(xiàn) 出 較 高 的 脫 色 率。這 與Schizophyllumsp. F17 分離得到的MnP 最適脫色溫 度 為35 °C［16］存 在 一 定 差 別。表 明Tramatessp.SQ01 MnP 在脫色時相對能耐受較高的溫度。酶是一種活性蛋白質(zhì)，溫度對酶促反應(yīng)有著較大的影響，適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)提高反應(yīng)溫度有利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行。在pH 值為4.5 時，脫色效果最佳，這與該酶最適pH 為4.5 一致［9］。而與白囊耙齒菌MnP 最適宜pH 值 為6.3 存 在 一 定 的 差 異［17］。Trametessp.SQ01 的MnP 最高耐受染料濃度為100 mg/L，且較低的染料濃度更有利于脫色的。而與其來源于同一菌株的漆酶在染料濃度為100 mg/L 時脫色率最大［10］?？梢?，雖然這兩種酶來源相同，但是它們對于底物濃度的特異性仍存在一定的差異。MnP 的最適脫色酶濃度為400 U/L。據(jù)報道Trametessp.SQ01 漆酶脫色RBBR 最適濃度為1 000 U/L［10］，可見這兩種木質(zhì)素過氧化物酶脫色染料的最適酶濃度具有差異性。從Schizophyllumsp. F17 分離的MnP 對偶氮染料剛果紅、橙黃G 和橙黃IV 的初始降解率分別為7.74、1.61 和1.38 mg/min。處理1 h后，對橙黃IV（1 mM）進(jìn)行的最高脫色率達(dá)到30%［16］。Trametessp. SQ01 MnP 脫 色 固 藍(lán)RR 鹽的最適脫色時間為4 h，橙黃G、氨基黑10B、剛果紅的最適脫色時間為2 h。可見不同來源的MnP 均能在較短時間內(nèi)對偶氮染料明顯地脫色。

綜上所述，來源于不同菌株的MnP 在最適脫色條件方面不盡相同，來源于同一菌株Trametessp.SQ01 的MnP 與漆酶對于底物濃度的特異性也存在一定的差異。經(jīng)過單因素、響應(yīng)面及棉織布脫色實(shí)驗(yàn)，可以看出Trametessp. SQ01 MnP 對偶氮染料及噻嗪染料染色的棉織布均有明顯的脫色效果。Zhang 等［18］研究發(fā)現(xiàn)Cerrena unicolorBBP6 產(chǎn)生的MnP 亦可脫色多種合成染料、降解多環(huán)芳烴并且對牛仔布也表現(xiàn)出較好的漂白效果?？梢?，MnP 在染料廢水生物脫色領(lǐng)域具有強(qiáng)大的應(yīng)用潛力，系統(tǒng)研究脫色條件對其脫色效果的影響，對該酶在工業(yè)脫色領(lǐng)域的應(yīng)用具有一定的參考價值。

5 結(jié)論

本文研究了Trametessp. SQ01 MnP 對偶氮染料脫色的能力及其影響因素，通過單因素實(shí)以及Box-Benhnken 組合實(shí)驗(yàn)得到最優(yōu)脫色條件，脫色4 h 脫色率為84.5%，對偶氮廢水的脫色工藝具有一定的參考價值。在最優(yōu)脫色條件下，采用MnP 對天青A 染色的棉織布進(jìn)行漂白應(yīng)用，經(jīng)過2 h 脫色率為16%。這表明Trametessp. SQ01 的MnP 在偶氮和噻嗪染料廢水生物脫色領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。