徐鴻洋，徐 晶，房 君，德寶軍，周歡敏

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)生物制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

谷 氨 酸 脫 氫 酶 （glutamate dehydrogenase，GDH）由谷氨酸脫氫酶基因（glutamate dehydrogenase 1，GLUD1） 編碼， 是谷氨酰胺代謝過程中以NAD+或NADP+作為輔助因子，催化谷氨酸氧化脫氨基轉(zhuǎn)變成α-酮戊二酸并進(jìn)入TCA 循環(huán)的關(guān)鍵酶之一［1-5］，也是α-酮酸在體內(nèi)轉(zhuǎn)化的主要途徑，由GDH 催化的谷氨酸氧化過程也是機(jī)體獲得ATP 的重要途徑［6］，該步驟的生化反應(yīng)方程式為：glutamate +H2O +NAD （P）+?α -ketoglutarate +NADPH+NH4++H+［7］。GDH 除了催化L-谷氨酸脫氨基， 還催化L-纈氨酸、L-亮氨酸等氨基酸脫氨基。

GDH 是一種線粒體酶，在哺乳動(dòng)物不同組織中的分布和活性不同，在肝臟中的活性最高，然后是腎臟、腦、骨骼肌以及白細(xì)胞［8-9］。 已有研究證實(shí)GLUD1 基因的高表達(dá)與細(xì)胞的增殖、 肝臟疾病、腫瘤發(fā)生等密切相關(guān)［10-13］。 對(duì)高胰島素—高血氨綜 合 征 （hyperinsulinism/hyperammonemia syndrome，HI/HA）［14］、帕 金 森 ?。╬arkinson′s disease，PD）［15-16］等疾病患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)患者GLUD1基因發(fā)生了特異性突變。 為探究大鼠、綿羊、梅花鹿不同組織中GLUD1 基因的表達(dá)情況， 比較人、小鼠、大鼠、山羊、綿羊、牛和豬GDH 蛋白的結(jié)構(gòu)差異，該研究通過采集大鼠、綿羊、梅花鹿的肝臟、腎臟、皮膚、脂肪和肌肉5 種新鮮組織樣品，提取各組織總RNA， 對(duì)不同動(dòng)物不同組織中GLUD1基因進(jìn)行qRT-PCR 分析，并比較人、小鼠、大鼠、山羊、綿羊、牛和豬7 個(gè)物種GDH 蛋白的氨基酸序列， 模擬這7 個(gè)物種的GDH 蛋白三維空間結(jié)構(gòu)， 為進(jìn)一步研究GLUD1 基因的表達(dá)模式與GDH 蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

大鼠肝臟、腎臟、皮膚、脂肪和肌肉組織采自內(nèi)蒙古自治區(qū)生物制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的成年大白鼠，綿羊肝臟、腎臟、皮膚、脂肪和肌肉組織采自內(nèi)蒙古烏蘭察布市四子王旗某屠宰場(chǎng)， 梅花鹿肝臟、腎臟、皮膚、脂肪和肌肉組織采自內(nèi)蒙古呼和浩特市土默特左旗某梅花鹿養(yǎng)殖場(chǎng)， 上述新鮮動(dòng)物組織在采樣結(jié)束后立即置于液氮罐中帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 數(shù)據(jù)下載

從反芻動(dòng)物基因組數(shù)據(jù)庫（http：//animal.nwsuaf.edu.cn/code/source/download/）和NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/） 中下載大鼠、綿羊、梅花鹿GLUD1 基因序列、內(nèi)參基因β-actin 序列、mRNA 序列以及人、小鼠、大鼠、山羊、綿羊、牛和豬GDH 蛋白氨基酸序列用于后續(xù)分析。

1.3 動(dòng)物組織總RNA 的提取與反轉(zhuǎn)錄

取“1.1”項(xiàng)下采集的動(dòng)物組織樣品，用無酶剪刀快速獲取適當(dāng)大小的組織塊置于無酶的1.5 mL離心管中， 使用研磨杵在液氮中將組織塊充分研磨成粉末，使用Trizol 裂解法（TaKaRa）提取各組織總RNA，使用Nanodrop 2000 檢測(cè)RNA 樣品濃度。根據(jù)TaKaRa 公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA；RT-PCR 反應(yīng)體系為10 μL：5×PrimeScript RT Master Mix 2 μL，RNA 樣品3 μL（共400 ng 以 上），ddH2O 5 μL；RT-PCR 反 應(yīng) 條件：37 ℃15 min；85 ℃5 s，4 ℃保溫。

1.4 GLUD1 基因的PCR 鑒定

用Primer Premier 5.0 軟件分別設(shè)計(jì)大鼠、綿羊和梅花鹿的β-actin 和GLUD1 基因引物， 引物序列見表1，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。 分別使用大鼠、綿羊和梅花鹿肝臟組織cDNA 樣品對(duì)β-actin 基因和GLUD1 基因進(jìn)行PCR 擴(kuò) 增，PCR 反 應(yīng) 體 系 為20 μL：Taq mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 模板2 μL（共100 ng 以上），ddH2O 6 μL；PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s， 退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸5 min；4 ℃保溫，退火溫度見表1；對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 各基因引物序列

1.5 熒光定量PCR 檢測(cè)不同動(dòng)物組織中GLUD1 基因的表達(dá)

以“1.3” 項(xiàng)下反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 樣品為模板，設(shè)置β-actin 為內(nèi)參基因，進(jìn)行熒光定量PCR（qRT-PCR）。熒光定量PCR 反應(yīng)體系為20 μL，包括TB Green Premix Ex Taq Ⅱ10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 模 板2 μL （共100 ng 以 上），ddH2O 6.4 μL； 反應(yīng)條件為：95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，72 ℃1 min，40 個(gè)循環(huán)； 兩步法試驗(yàn)結(jié)束后， 得到qRT-PCR 的擴(kuò)增曲線和融解曲線，計(jì)算Ct 值，進(jìn)行后續(xù)GLUD1 基因表達(dá)分析。 使用無重復(fù)雙因素分析方法進(jìn)行各組織GLUD1 基因表達(dá)量的差異分析。

1.6 不同物種GDH 蛋白的氨基酸序列比對(duì)分析

將下載得到的人、小鼠、大鼠、山羊、綿羊、牛和豬7 個(gè)物種GDH 蛋白的氨基酸序列使用python 腳本進(jìn)行局部比對(duì)，將比對(duì)得到的.aln 文件導(dǎo)入ESPript 3.x（http://espript.ibcp.fr）工具進(jìn)行全局比對(duì)， 得到比對(duì)文件進(jìn)行后續(xù)氨基酸突變位點(diǎn)的篩選。

1.7 GDH 蛋白三維空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

根據(jù)各物種的氨基酸序列， 使用SWISSMODEL 對(duì)蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝臟組織cDNA 樣品中β-actin 和GLUD1基因的PCR 鑒定

經(jīng)PCR 鑒定，大鼠、綿羊和梅花鹿肝臟組織中存在β-actin 和GLUD1 基因的表達(dá)，β-actin 和GLUD1 基因在大鼠、綿羊和梅花鹿肝臟樣品中的擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 長(zhǎng) 度 分 別 為76、115、167、274、157、129 bp（見圖1）。

圖1 β-actin和GLUD1 基因在大鼠、綿羊、梅花鹿的肝臟組織PCR 鑒定結(jié)果

2.2 不同動(dòng)物組織樣品中GLUD1 基因的表達(dá)量

經(jīng)qRT-PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GLUD1 基因在大鼠、綿羊和梅花鹿的肝臟組織中的表達(dá)量高于在其他組織中的表達(dá)量；GLUD1 基因大鼠腎臟中的表達(dá)量也較高， 肌肉組織中該基因的表達(dá)水平低于在肝腎組織中的表達(dá)水平， 皮膚和脂肪組織中該基因的表達(dá)量較低；GLUD1 基因在綿羊和梅花鹿的肌肉組織中表達(dá)量較高， 僅次于在肝臟中的表達(dá)量，高于在腎臟中的表達(dá)量；綿羊和梅花鹿的脂肪組織中GLUD1 基因的表達(dá)水平低于肌肉組織中的表達(dá)水平，但高于在皮膚組織中的表達(dá)水平，而在大鼠組織中則相反（見圖2）。

圖2 GLUD1 基因在大鼠、綿羊和梅花鹿各個(gè)器官中的表達(dá)量

通過對(duì)比大鼠、 綿羊、 梅花鹿肝臟組織中GLUD1 基因的相對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn)該基因在大鼠和梅花鹿肝臟中的表達(dá)量極顯著（P<0.01）高于在綿羊肝臟組織中的表達(dá)量， 而大鼠與梅花鹿肝臟組織中該基因的表達(dá)量差異不顯著（P>0.05）。 通過比較發(fā)現(xiàn)GLUD1 基因在大鼠和綿羊腎臟組織中的表達(dá)量極顯著（P<0.01）高于在梅花鹿腎臟組織中的表達(dá)量（見圖3）。

圖3 不同動(dòng)物相同組織樣品中GLUD1 基因的表達(dá)量

2.3 7 個(gè)物種間GDH 蛋白的氨基酸序列比對(duì)與物種特異性突變位點(diǎn)的篩選

通過對(duì)人、小鼠、大鼠、山羊、綿羊、牛和豬7個(gè)物種GDH 蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)大鼠與小鼠GDH 蛋白的氨基酸序列高度相似，序列相似度達(dá)到99.10%， 人GDH 蛋白的氨基酸序列與豬、牛、山羊和綿羊的序列相似性較高；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)在大鼠GDH 蛋白氨基酸序列中有2 個(gè)物種特異性突變位點(diǎn)， 分別為序列的第8 位和第40 位氨基酸， 且2 個(gè)位點(diǎn)的氨基酸都由丙氨酸（Ala）突變?yōu)槔i氨酸（Val）；在人GDH 蛋白氨基酸序列中有1 個(gè)物種特異性突變位點(diǎn)， 在序列的第23 位，該位點(diǎn)的氨基酸由丙氨酸（Ala）突變?yōu)榻z氨酸（Ser）；在豬GDH 蛋白氨基酸序列中有2 個(gè)物種特異性突變位點(diǎn)，為序列的第33 位和第39 位，2 個(gè)位點(diǎn)的氨基酸都由丙氨酸（Ala）突變?yōu)樘K氨酸（Thr）； 物種間GDH 蛋白的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果見圖4。

圖4 7 個(gè)物種間GDH 蛋白的氨基酸序列比對(duì)圖

2.4 不同物種間GDH 蛋白三維空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

通過對(duì)7 個(gè)物種GDH 蛋白三維立體結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，小鼠、大鼠和人GDH 蛋白的結(jié)構(gòu)相似，為三聚體結(jié)構(gòu)；山羊、綿羊、牛和豬的GDH 蛋白的結(jié)構(gòu)相似，為同源六聚體結(jié)構(gòu)，與已報(bào)道的天然GDH［17］蛋白的結(jié)構(gòu)一致（見圖5）。

圖5 7 個(gè)物種GDH 蛋白三維立體結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與比較

3 討論

谷氨酸脫氫酶作為一種分布于肝臟、 心肌和腎細(xì)胞線粒體基質(zhì)及內(nèi)膜等部位的含鋅線粒體酶，在肝臟組織中的活性最高，參與肝臟中多種氨基酸的代謝過程， 當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)分布于肝細(xì)胞線粒體內(nèi)的GDH 濃度會(huì)明顯升高，GLUD1 基因通過表達(dá)GDH 蛋白控制其產(chǎn)物α-酮戊二酸在細(xì)胞內(nèi)的含量， 實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)能量產(chǎn)生和氧化還原反應(yīng)的平衡［18-20］。 當(dāng)GLUD1 基因的表達(dá)水平異常升高時(shí)會(huì)使機(jī)體細(xì)胞增殖異常，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，而干擾該基因的表達(dá)會(huì)使癌細(xì)胞增殖、 遷移和侵襲能力明顯下降［21］。 若敲除該基因則可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)［22］，因此，GDH 蛋白也逐漸成為許多腫瘤治療的靶點(diǎn)。 統(tǒng)計(jì)研究也發(fā)現(xiàn)，GLUD1 基因的序列變化會(huì)使GDH 蛋白調(diào)節(jié)域中氨基酸的替換，導(dǎo)致疾病的發(fā)生［23］。

不同動(dòng)物的不同組織中GLUD1 基因的表達(dá)水平有所不同， 可能受動(dòng)物個(gè)體所處的狀態(tài)等因素的影響，但物種間同一組織、物種內(nèi)不同組織間該基因的表達(dá)依舊具有一定規(guī)律， 根據(jù)以往的報(bào)道，GDH 蛋白在動(dòng)物的肝臟中活性和表達(dá)水平較高，通過比較物種內(nèi)不同組織間GLUD1 基因的表達(dá)量， 發(fā)現(xiàn)動(dòng)物的肝臟組織中該基因的表達(dá)水平明顯偏高， 而通過比較不同物種同一組織中該基因的表達(dá)情況， 發(fā)現(xiàn)各個(gè)物種之間該基因表達(dá)水平的差距較大， 揭示該基因在不同動(dòng)物的相同組織中發(fā)揮功能的方式可能有所不同。 GDH 蛋白氨基酸序列的差異關(guān)乎該蛋白功能的發(fā)揮， 通過序列比較，發(fā)現(xiàn)物種間該蛋白的序列差異較大，從序列水平上看小鼠、大鼠的序列相似性較高，與其他物種的序列差異較大， 通過模擬蛋白質(zhì)的功能發(fā)現(xiàn)人的GDH 蛋白氨基酸序列雖然與大鼠的序列差異較大， 但蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與大鼠的更相似，因此，猜測(cè)人的GDH 蛋白功能可能與大鼠體內(nèi)該蛋白的功能更相似。通過篩選7 個(gè)物種GDH 蛋白氨基酸序列發(fā)現(xiàn)了數(shù)個(gè)在人、 大鼠和豬中發(fā)生的物種特異性突變位點(diǎn)， 有趣的是這些突變位點(diǎn)都集中在一定的序列范圍內(nèi)， 說明該區(qū)域的氨基酸可能較其他位置更容易發(fā)生突變， 這有待進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。

4結(jié)論

該研究對(duì)大鼠、綿羊和梅花鹿3 個(gè)物種的5種組織樣品通過qRT-PCR 檢測(cè)GLUD1 基因在這些組織中的相對(duì)表達(dá)量，并比較了人、大鼠、小鼠、山羊、綿羊、牛和豬7 個(gè)物種GDH 蛋白的氨基酸序列和蛋白空間結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GLUD1 基因在不同動(dòng)物不同組織中的表達(dá)量差異較大，該基因在大鼠、綿羊、梅花鹿肝臟中都有較高水平的表達(dá)，這可能與肝臟中GDH 蛋白的表達(dá)水平和活性密切相關(guān)。 不同物種中GDH 蛋白的氨基酸序列相似度較高， 但依舊存在一定的序列差異性， 同時(shí)存在數(shù)個(gè)對(duì)應(yīng)物種特異性的氨基酸突變位點(diǎn)， 這些位點(diǎn)的差異可能會(huì)影響動(dòng)物細(xì)胞功能。